3.2: 内部标准

1.适当的样品处理: 制作解决方案

1. 带上干净的烧杯和大众正确的样品量到它。记录实际的大规模使用。在此示例中，腺嘌呤的解决方案是在容量瓶作为一种内部的标准用于下一个分析。腺嘌呤的质量是 100 毫克。做不直接大规模到容量瓶，因为它有一个长脖子和腺嘌呤不能轻松地添加或删除。
2. 添加约 25 毫升的溶剂 (在这种情况下二甲基亚砜 (DMSO)) 的烧杯和让它搅拌溶解。在此示例中，最后的解决办法是在 50 毫升的容量瓶，所以只添加约 25 毫升，所以可以冲洗烧杯和解决方案到最后卷组成。
3. 一旦溶解固体，溶液倒入容量瓶。
4. 冲洗烧杯和少量的溶剂，约 10 毫升，搅拌棒，倒入容量瓶的冲洗。重复两次以上。这有助于确保适当的解决方案转移。

2.内部标准校准曲线的制备

1. 气相色谱法分析准备所需的标准样品。在此示例中，从咖啡用乙腈提取咖啡因和腺嘌呤然后作为一种内部的标准用于测量。
2. 对于咖啡因的样本，称出 1 毫克/毫升样品所需的样品的取样量。如果使用 10 毫升的容量瓶，那是 10 毫克。
3. 进一只量杯权衡分析物，添加几毫升的溶剂 （这里的甲醇） 以溶解，然后定量地转移到容量瓶使用 3 冲洗。
4. 以类似的方式与 0.2、 0.5、 2 毫克/毫升咖啡因使 3 更多的标准。
5. 放在每个咖啡因 1 毫升标准样品瓶。
6. 添加到每个样品瓶 0.2 毫升的 2 毫克/毫升腺嘌呤内部标准。
7. 与每个咖啡因标准运行气相色谱法测定实验。对于每个色谱图，计算的峰面积为咖啡因 vs 比标准。
8. 绘制一个地区比 vs 的浓度比。那情节的斜率是响应因子。

3.与内部标准实际样品的制备气相色谱法

1. 气相色谱法分析的准备所需的样品。在此示例中，咖啡因被提取使用 acetrontrile 的咖啡。
2. 有关咖啡的示例，大规模出的咖啡注入 100 mL 烧杯 2 g。记录了咖啡的准确重量。
3. 向烧杯中添加 20 毫升的乙腈。
4. 让它坐了 20 分钟，不断搅拌。
5. 筛选出用漏斗滤纸咖啡的理由。
6. 冲洗过滤纸 3 x 与少量的乙腈 （5 毫升）。
7. 最后量度的滤液。它应该是大约 35 毫升。

4.运行示例并计算浓度

1. 取 1 毫升的咖啡提取物样品，在小瓶中添加 0.2 毫升的内部标准。将小瓶放入自动取样器机架。
2. 运行的样品的气相色谱分析。请确保 GC 条件这样的咖啡因和腺嘌呤分开。在此示例中，等温分色被执行在 200 ° c。
3. 经过分析，计算分析物的峰和内标峰的峰面积。使用他们的比率，计算样品中咖啡因的量。

5.咖啡因的内部标准结果: 气相色谱分析

1. 咖啡因的气相色谱分析如图 1所示。腺嘌呤用作内部的标准。峰面积比可以测量和绘制 vs 浓度的比例。边坡是情节的响应因子 （在本例中 1.8）。
2. 图 2显示了一份咖啡样品和腺嘌呤内部标准图谱。峰面积的比值是 1.78。使用响应因子和腺嘌呤 （0.33 毫克/毫升） 的已知的浓度，计算出未知样品中的咖啡因浓度是 0.33 毫克/毫升。

图 1。使用内标校正标度图。一块的面积比率 vs 浓度比值为 3 标准样品的咖啡因 （1，0.5 和 0.2 毫克/毫升） 0.33 毫克/毫升腺嘌呤内部标准添加到每个。直线的斜率是 1.8，即响应因子。

图 2。咖啡与腺嘌呤内部标准图谱。对样品的 FID 检测器响应一个阴谋。三个主峰是腺嘌呤 (IS)，咖啡因和棕榈酸。

每次处理或转移样品时都可能发生样品损失，因此难以准确计算浓度。

为确保准确性，必须通过仔细的样品制备和限制样品处理和转移步骤的数量来最大限度地减少样品损失的影响。然而，样品损失也可能是由于系统误差造成的，例如样品作不完整、基质效应和分析程序的变化。

这些损失来源可以通过将已知浓度的物质相似但不完全相同的物质添加到目标化合物中来解释。这称为内标。内标发生的任何样品损失都应与分析物相似，以便准确计算浓度。

本视频将说明在测定未知物浓度时，如何使用内标和适当的实验室技术来考虑样品损失。

内标是在分析过程中以已知量添加到标准品、样品和空白样中的物质。

在色谱和光谱学中，计算内标与分析物的信号比值。该比率称为响应因子，与分析物浓度和标准浓度的比率成正比。

响应因子 R 可由以下公式表示，其中 A 表示样品和内标的分析信号，C 表示样品和内标的浓度。

内标可以补偿系统误差和随机误差。例如，测量样品时的随机误差（例如不一致）对于内标和分析物都是相同的。因此，它们的信号比率不会改变。

对于系统误差，例如溶液中的基质效应，只要标准品和分析物的基质效应相等，该比率就不受影响。

虽然内标有很大的好处，但可能很难选择合适的标准。内标的信号必须与分析物相似但不完全相同。它也不能以任何方式影响分析物的测量。

最后，浓度必须众所周知。这是通过确保样品中不存在内标来实现的;因此，它在溶液中的唯一来源是添加的已知浓度。

在下面的实验中，将通过气相色谱法测定未知样品中咖啡因的浓度。

这是通过使用已知的咖啡因溶液创建校准曲线，以腺嘌呤为内标来实现的。校准曲线的斜率等于响应因子。

一旦知道响应因子，就可以根据测得的色谱图面积比计算未知物的浓度。

现在您已经了解了内部标准的基础知识，让我们看一下该过程。

开始作时，准确称取 100 mg 内标腺嘌呤放入干净的烧杯中。

接下来，将其溶解在大约 20 mL 的二甲基亚砜中，并混合溶液。

腺嘌呤溶解后，将溶液倒入 50 mL 容量瓶中。

用 10 mL DMSO 冲洗烧杯和搅拌棒，然后将冲洗液倒入烧瓶中。重复冲洗两次，以确保溶液正确转移。填充至校准标记处，得到浓度为 2 mg/mL 的内标。

接下来，称取 100 毫克咖啡因放入烧杯中，制备储备液。用少量甲醇溶解咖啡因。然后，使用 3 次冲洗将此溶液转移到新的 25 mL 容量瓶中。这是 4 mg/mL 储备液。用它来创建 3 个咖啡因标准品。

接下来，向每个培养瓶中加入 0.2 mL 内标腺嘌呤。用甲醇填充每个样品至最终体积。将每种溶液转移到样品瓶中。

通过气相色谱仪运行每种咖啡因标准品。计算咖啡因与腺嘌呤标准品的峰面积比。

首先，称取 2 克咖啡放入 100 mL 烧杯中，并记录重量。

接下来，加入 20 mL 甲醇以从咖啡中提取咖啡因。让溶液搅拌 20 分钟。

使用 B？chner 漏斗过滤掉咖啡渣。用少量甲醇冲洗烧杯，然后将冲洗液倒入漏斗中。重复冲洗两次。

测量滤液的最终体积;它应该大约为 35 mL。

要制备用于分析的样品，请在样品瓶中加入 1 mL 咖啡提取物。然后，加入 0.2 mL 腺嘌呤内标，将样品瓶放入仪器的自动进样器架中。

对样品进行气相色谱分析，确保条件使咖啡因和腺嘌呤分离。

完成分析后，计算内标和分析物的峰面积。

分析完所有样品后，可以通过绘制峰面积与浓度比值来确定咖啡因/腺嘌呤溶液的标准校准曲线。这条线的斜率（表示响应因子）为 1.8。

接下来，分析提取的咖啡样品中的 GC 数据。计算出峰面积的比值为 1.78。使用响应因子和内标腺嘌呤的已知浓度，计算出未知样品中的咖啡因浓度为 0.33 mg/mL。

不同科学领域的许多不同类型的反应都使用内标来最大限度地减少误差和样品损失的影响。

使用内标可以最大限度地减少样品制备过程中遇到的样品损失的影响，同时保持其浓度比几乎恒定。

在这个例子中，使用液-液萃取工艺从裂解的细胞中提取生物活性脂质。在萃取开始时加入稳定同位素内标，以解决样品制备过程中的误差。

内标不仅对生物活性脂质的制备至关重要，而且对分析也至关重要。使用高效液相色谱分离脂质，并通过质谱分析。

在光谱学中，内标可以帮助校正由于光源强度变化引起的随机误差。如果灯或其他光源具有可变功率，则会影响样品的吸收，从而影响样品的发射。然而，即使光源不恒定，内标与分析物的比率也将保持不变。在色谱法中

中，最大的误差来源之一是进样。自动进样器有助于最大限度地减少这种情况，但误差仍可能为 1？2% 的相对标准偏差。

在本例中，使用气相色谱分析含有内标的蒸气标准品，以建立校准曲线。一旦完成，就可以测量未知样品，并考虑样品挥发性造成的损失。

您刚刚观看了 JoVE 对内部标准的介绍。现在，您应该了解尽可能减少样品损失、内标和响应因子的最佳实践。

感谢观看！