内标物

1. 正确的样品处理：配制溶液

1. 取一个洁净的烧杯，称取适量样品放入其中，记录实际使用质量。本示例中，在容量瓶中配制腺嘌呤溶液，作为后续分析的内标。腺嘌呤的质量为 100 mg。切勿直接在容量瓶中称量，因其瓶颈较长，腺嘌呤难以加入或取出。
2. 向烧杯中加入约 25 mL 溶剂（本例中为二甲基亚砜（DMSO）），搅拌至溶解。本示例中最终溶液在 50 mL 容量瓶中定容，因此仅加入约 25 mL 溶剂，以便后续冲洗烧杯并将溶液转移至最终体积。
3. 待固体完全溶解后，将溶液倒入容量瓶中。
4. 用少量溶剂（约 10 mL）冲洗烧杯和搅拌子，并将洗涤液倒入容量瓶中，重复此操作两次。这有助于确保溶液完全转移。

2. 内标校准曲线的制备

1. 为气相色谱分析准备所需的标准样品。本示例中，使用乙腈从咖啡中提取咖啡因，然后使用腺嘌呤作为内标物进行测量。
2. 对于咖啡因样品，称取配制浓度为 1 mg/mL 所需量的样品。若使用 10 mL 容量瓶，则称取 10 mg。
3. 将分析物称入烧杯中，加入几毫升溶剂（此处为甲醇）溶解，然后用溶剂冲洗 3 次，定量转移至容量瓶中。
4. 以相同方法制备另外 3 个浓度分别为 0.2、0.5 和 2 mg/mL 的咖啡因标准样品。
5. 将每种咖啡因标准溶液各取 1 mL 加入样品瓶中。
6. 向每个样品瓶中加入 0.2 mL 浓度为 2 mg/mL 的腺嘌呤内标溶液。
7. 对每种咖啡因标准溶液进行气相色谱实验。对每张色谱图，计算咖啡因与内标物的峰面积比值。
8. 绘制峰面积比值与浓度比值的关系图。该图的斜率即为响应因子。

3. 气相色谱内标法实际样品的制备

1. 准备用于气相色谱分析的所需样品。在此示例中，使用乙腈从咖啡中提取咖啡因。
2. 对于咖啡样品，称取 2 g 咖啡至 100-mL 烧杯中。记录咖啡的精确质量。
3. 向烧杯中加入 20 mL 乙腈。
4. 静置 20 分钟，期间频繁搅拌。
5. 使用漏斗中的滤纸过滤除去咖啡渣。
6. 用少量乙腈（5 mL）冲洗滤纸 3 次。
7. 测量滤液的最终体积，应约为 35 mL。

4. 运行样品并计算浓度

1. 取1 mL咖啡提取物样品，加入0.2 mL内标物至样品瓶中。将样品瓶放入自动进样器样品架。
2. 运行样品的气相色谱分析。确保气相色谱条件能使咖啡因和腺嘌呤分离。本示例中，在200 °C下进行等温分离。
3. 分析完成后，计算内标物峰和分析物峰的峰面积。利用峰面积比值，计算样品中咖啡因的含量。

5. 结果：采用内标法对咖啡因进行气相色谱分析

1. 咖啡因的气相色谱分析结果如图1所示。腺嘌呤用作内标物。可通过测量峰面积比值并对其浓度比值作图。该图的斜率即为响应因子（本例中为1.8）。
2. 图2显示了含有腺嘌呤内标物的咖啡样品的色谱图。峰面积比值为1.78。利用响应因子和已知的腺嘌呤浓度（0.33 mg/mL），计算得出未知样品中咖啡因的浓度为0.33 mg/mL。

图1. 使用内标法的校准曲线图。 三种咖啡因标准样品（1、0.5 和 0.2 mg/mL）与每种样品中添加的 0.33 mg/mL 腺嘌呤内标物的峰面积比相对于浓度比的图示。直线的斜率为 1.8，即为响应因子。

图 2. 含腺嘌呤内标物的咖啡样品色谱图。 FID 检测器对样品响应值的图谱。三个主要峰分别为腺嘌呤（内标物）、咖啡因和棕榈酸。