监测双层膜弹性性质变化的单分子方法

大家好，我是来自纽约市威尔康奈尔医学院生理学与生物物理学系的 Ola Anderson 博士。我叫 Olson，是 Olive Anderson 实验室的一名计算生物医学专业学生。

我是Shail Collingwood，来自Anderson实验室的一名研究技术员。今天我们将向您展示如何形成平面双分子层，如何使用Biolayer Punch电极分离一小片膜，如何记录单通道活性，以及如何分析结果，从而将Gramin通道用作探测脂质双层特性的工具。在之前的视频中，我们已经向您介绍了如何为这些实验做好准备。

我们向您展示了如何制备所使用的记录腔室，以及如何制备双层膜穿孔电极，该电极用于分离出用于记录通道活性的微小膜区域。现在我们开始制备双层膜。首先，在预涂脂的腔室的每个区室中加入 2.5 mils 温度已平衡的电解液溶液，以开始双层膜实验的设置。我们通常使用的溶液为 1 摩尔氯化钠加上 10 毫摩尔缓冲剂。

将样品缓冲至pH 7，调节显微镜和光源，使聚四氟乙烯上的孔位于视野中央并被明亮照亮。将玻璃微移液管插入微电极夹持器中。用一段特氟龙管将注射器连接至夹持器。

通过抽吸将移液管填充到电极架中。注意避免产生气泡，因为气泡可能会中断电极架中的银粒与移液管尖端之间的电连接。在螺钉上涂抹少量凡士林，然后将其放入微电极架中。

凡士林有助于形成密闭的密封环境。将电极夹持器插入法拉第笼内的膜片钳头期装置中。将微移液管尖端对准聚四氟乙烯隔板小孔的正后方并居中放置。

将盘绕的银电极放入前室，用油泥固定，并将其连接到电压指令电路。最后，平衡电极。

这一点至关重要，因为前方的电极与微电极架中的电极可能具有略微不同的半电池电位。半电池电位是指银金属电极与邻近氯化银涂层的电解液溶液之间的电位差。通过调节手动偏移量，使两个隔室之间在膜片钳上流动的电流在负200至正200皮安之间波动，从而实现电极的平衡。

偏移电位会随时间变化，因此在整个实验过程中需定期平衡电极以形成脂双层膜。按照随附视频中的说明，用 fch 溶液清洗一支经过火焰抛光的旧移液管。将清洗后的移液管浸入脂质铺展溶液中，使溶液在移液管内上升约一毫米。

将移液器吸头置于聚四氟乙烯（Teflon）隔膜小孔前方，轻轻将脂质溶液吹出，在小孔上形成一个脂质气泡。操作成功时，脂质气泡会跨越小孔形成明亮的彩色膜，其边缘呈环状或类似面包圈的形状，并与聚四氟乙烯隔膜相连。让膜自然变薄，可通过在膜两侧施加 100 至 200 毫伏的电势来促进此过程。

将玻璃微电极尖端放入Taurus中，静置几分钟，以使微电极与双层膜之间形成更好的密封。此时，您已准备好使用玻璃微电极分离膜片。现在用杀稻草剂（gramin）对膜进行处理。

该植物碱溶液由1微摩尔的母液稀释至1至10纳摩尔而成。在二甲基亚砜中，通常将稀释液每侧各加入1至10微升至膜两侧，使终浓度处于皮摩尔浓度范围。使用磁力搅拌子搅拌溶液约两分钟，然后等待10分钟，再形成新的小膜以记录单通道活性。

该时间权重允许将短杆菌肽掺入膜中。通过施加电压检测通道活性。通常，我们希望每秒大约有一个通道事件。

通道表现为膜电流的离散向上和向下变化。现在您已准备好开始实际实验。首先，记录对照电流轨迹。

按照之前演示的方法平衡电极，参照配套视频中的描述形成一个小膜或膜片。施加 +200 毫伏电压并记录单通道电流活动。应采集 100 至 200 次单通道电流转变事件。

以负200毫伏重复此步骤。通过移液管尖端排出电解质以破坏膜片。使用尼龙螺钉重新平衡电极，将移液管退至后室，吹出多余的脂质并形成新的膜片。

您也可以重复这些步骤，以在其他电位下进行记录。现在，您已准备好在双层膜修饰剂存在下记录实验电流轨迹。在本例中，将抗抑郁药氟西汀添加到膜的两侧。

应将氟西汀储备液用DMSO稀释至25毫摩尔。向槽中加入5微升该溶液，以达到50微摩尔的浓度。DMSO可能影响双层膜的性质，因此需将溶液中DMSO的体积限制在25微升（1%）或150毫摩尔以内。

搅拌5分钟，然后等待10分钟，使修饰剂在水溶液与膜之间达到平衡。现在，按照之前所述方法记录在修饰剂存在下的通道活性。重复这些步骤，以记录修饰剂浓度逐步增加时的通道活性。

通过量化通道寿命和出现速率，我们可以深入了解双层膜的变化。为了进行此类分析，我们需要检测通道的形成和消失。在此，我们使用一种基于转换的算法，计算机通过计算电流的一阶导数来确定电流的快速变化，并将这些变化标记为通道事件。

这些事件以时间序列的形式存储，以帮助我们确定通道在转换前后的开放时间。电流水平也被存储下来，并有助于在实验进行过程中确定通道的电流幅度。计算机构建电流转换幅度直方图，使您能够实时跟踪电流转换的获取情况。

它还能帮助您评估实验的质量。如果当前的转换幅度分散较大，则说明存在问题；如果直方图分布紧密，则表明实验进行得良好。

当累积的跃迁事件超过 200 次时，计算主峰中跃迁事件的平均电流及其标准偏差。您可以通过将电流跃迁幅度直方图中的跃迁次数除以观测时间，来估算通道出现速率。请注意还需再除以 2，因为在直方图中，通道每次出现和消失时各被计数一次，共被计数两次。

分析转换事件的时间序列，以获得通道寿命分布。在任意时刻最多只有一个导电通道的电流轨迹中，确定寿命是直接可行的。在这种情况下，计算机会检测每次转换是通道出现还是消失，且一次消失事件只能归属于前一次出现事件。

两次转换之间的时间即为通道寿命。当通道转换发生得过于接近而无法区分时，您必须手动指定通道的出现和消失。如果存在两个或更多同时导通的通道，该指定过程将更为复杂，因为此时您无法确定哪一个通道的消失对应于哪一个通道的出现。

因此，最好具有较低的通道活性。您可以通过使用随机数生成器将出现事件与消失事件进行配对，从而解决分配问题。这样，您将得到一系列通道寿命数据。

这被转化为一个寿命直方图，继而转化为生存曲线，通过使用非线性最小二乘法曲线拟合对生存曲线拟合单指数分布来确定平均寿命，并针对大膜未破裂的实验进行分析。当加入双层膜调节剂时，可以比较其对通道出现速率的影响。如果大膜破裂，则不应进行此类比较，因为膜蛋白功能受细胞膜脂质组成调控。

这种调控源于特定的脂质-蛋白质相互作用以及脂质双分子层与膜蛋白之间更普遍的相互作用。这些相互作用在药理学研究中尤为重要。因为目前市场上许多药物都具有两亲性，能够改变脂质双分子层的性质，进而导致膜蛋白功能的改变。

离子通道可作为分子力换能器，用于报告两亲性分子是否能够改变脂双层的性质。通过绘制通道寿命和出现速率随调节剂浓度变化的曲线，可以深入了解脂双层性质的变化。

频率增加意味着双分子层更容易发生形变，以容纳革兰氏菌结合位点并促进二聚化。寿命延长意味着与通道形成相关的双分子层形变在能量上代价更低。某种调节剂可能通过增加膜的弹性或影响膜曲率，从而提高频率和寿命。

现在我们已经展示了如何使用色通道来检测小分子是否改变了弹性双层膜的性质。就这些。感谢观看。

祝您的实验顺利。