Name: 电生理实验人工双层膜的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习制备平面脂质双层膜用于单通道电生理实验，使用Teflon隔室和玻璃微电极。该方法为离子通道研究提供可控环境，确保实验可重复性。

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有关制备人工双层膜以及利用短杆菌肽通道探测膜弹性的更多信息，请访问 <a href="http://springerprotocols.com/index.vm">Springer Protocols</a>。

作者无任何利益冲突需要披露。

用于电生理实验的人工双层膜制备

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

平面脂质双层，也称为人工脂质双层，可让您在明确定义的环境中研究离子导电通道。此类双层膜可用于多种不同研究，例如膜活性肽的表征、离子通道的重建，或探究脂质双层特性变化如何影响跨膜通道功能。本文中，我们展示如何形成平面双层膜，以及如何从双层膜上分离出小片区域；在第二段视频中，还将演示利用短杆菌肽通道测定脂质双层弹性性质变化的实验方法。此外，我们还展示了制备双层膜腔室、电极所需的各个步骤，以及如何检测双层膜是否适用于单通道记录测量。

平面脂双层，也称为人工脂双层，可让您在明确定义的环境中研究离子导电通道。本文中，我们演示了制备脂双层室、电极所需的各个步骤，以及如何检测脂双层是否适用于单通道记录测量。

平面脂双层，也称为人工脂双层，可让您在明确定义的环境中研究离子传导通道。这些脂双层可以……

您好，我是来自纽约市威尔康奈尔医学院生理学与生物物理学系的 Olaf Anderson 博士。您好，我是 Olaf Anderson 博士实验室的医学博士生 Ruchi Kaur。您好，我叫 John Kim。我是一名研究技术员。今天我们将向您展示如何在纯脂质双层膜中进行单通道实验的准备工作。我们将向您演示如何准备实验腔室，以及如何制备双层膜穿孔电极。我们过去常隔离出进行测量的小片膜区域。那么，让我们开始吧。我们的电生理实验装置包括以下部分：一个悬浮在空气中的防震台，用于最大限度减少机械振动；一个法拉第笼，用于屏蔽电噪声、声音和振动；以及一个支架。对于双层室实验，我们采用循环水夹套进行温度控制，将双层室置于其中，并使用显微操作器固定膜片钳放大器的前置放大头阶段。使用电子滤波器单元对膜片钳放大器输出信号在500赫兹处进一步滤波。为了观察电流转换，使用示波器显示电流信号，包括膜片钳放大器的输出信号以及电子滤波器的输出信号。最后但同样重要的是，您需要一台配备数据采集系统的计算机，用于将膜片钳信号数字化。我们以 20 千赫兹的采样频率使用自行开发的软件进行数据记录和分析。所有设备均需在实验开始前 20 分钟开启。接下来，我们将准备进行实验的腔室。该腔室通过隔膜分为两半，隔膜由一张约100微米厚的薄聚四氟乙烯（Teflon）片制成，并充满电解质溶液。我们在隔膜的孔洞上形成双层膜，以连通两侧的电解质溶液。孔的直径应为1至1.5毫米。使用凡士林作为密封剂，在特氟龙腔室前半部分放置一块玻璃窗，将不锈钢螺丝穿过一个金属支架和后半腔室上的四个孔。使用凡士林作为密封剂，放置一个圆形特氟龙隔板，使其被夹在组装后腔室的两半之间。确保隔板上的孔居中。在隔板两侧涂抹凡士林，以保证电解液室密封不漏水且电学隔离。继续将螺钉穿过腔室的前半部分和前部金属支架。拧紧组件以确保所有部件牢固固定，但不要过紧，以便于清洁腔室并清除凡士林。将巴斯德吸管在火焰上抛光并弯成直角。将吸管尖端烧制并抛光至光滑，有助于避免划伤玻璃或聚四氟乙烯（Teflon）表面。接下来，使用氯仿与甲醇按2:1比例配制的溶液或FCH溶液清洗腔室。用移液器吸取FCH溶液，去除多余的凡士林，注意不要将凡士林涂抹到聚四氟乙烯（Teflon）和玻璃表面。所用FCH溶液体积应至少为腔室体积的10倍。完成此步骤后，向腔室中加入磁力搅拌子。然后用95%乙醇清洗腔室，最后用高纯度水（如蒸馏水、超纯水或同等纯度的水）清洗。与之前一样，使用经过火焰抛光的巴斯德吸管吸取液体。最后，用FCH乙醇和水重复清洗，然后用水、乙醇和fol清洗。现在我们将制作玻璃电极微移液管，该电极将作为与记录室后室连接的电信号通路。使用 Sutter Instruments 公司的 P-97 型 Flaming/Brown 微移液管拉制仪，将玻璃毛细管拉制成两根微移液管，每根均具有尖锐且短锥形的末端。我们使用的毛细管由硼硅酸盐玻璃制成，外径为 0.8 毫米，内径为 0.5 毫米。将一根玻璃毛细管放入拉制仪中并固定，以准备进行拉制。电极拉制仪应使用铂金材质，因为我们此前使用钨丝电极拉制仪拉制移液管并未成功。接下来的几个步骤将在带有铂金丝的微雕仪中进行。在使用微雕仪之前，应确保铂金丝已均匀地涂覆上玻璃。可以使用软质的钠钙玻璃或硬质的硼硅酸盐玻璃。需要调节显微火焰的热量，使玻璃均匀流畅地熔化，并在灯丝表面形成一层均匀的薄层。现在将微移液管安装到显微火焰上，然后折断其尖端。我们通过在相对较低的温度下轻轻软化灯丝上的玻璃涂层来实现这一点。然后将微移液管尖端缓慢移向灯丝上的玻璃涂层，使两者熔合在一起，随后关闭灯丝的加热，灯丝回缩，微移液管随之断裂。此时我们便得到一个直径约30微米、开口尖锐且均匀的末端。再次使用微电极拉制仪，在微移液管尖端后方三到四毫米处制作一个直角弯折，将移液管置于纤丝上方数百微米处，然后开启加热，使纤丝发红。由于热膨胀作用，纤丝会发生移动。随后轻轻将移液管下压至纤丝上，纤丝即会弯曲。通过调节灯丝的温度来控制弯曲的程度。当弯曲角度达到约80度时，迅速将移液管向上并向前移动。这需要一定的协调性。您需要使用相同的设置最终形成一个90度的弯角。对微量移液器尖端进行火焰抛光，并保持灯丝涂有玻璃。现在，我们用10%的三辛基硅烷苯溶液对移液器尖端进行硅烷化处理。这会使移液管表面具有疏水性，从而更好地与膜相互作用。让溶液通过毛细作用上升几毫米进入移液管内。使用微火焰加热器在低温下将溶液蒸发，即可完成处理。接下来我们将向您展示如何制备银电极。取一段长约五厘米、直径约一毫米的银丝，将其卷成内径为两到三毫米的线圈，缠绕三至四圈即可。保留其余部分作为尾部，使其弯曲成与螺旋部分呈直角。将尾部以及相邻的5至10毫米长的银丝用熔融的氯化银涂覆。现在配制形成双层膜的溶液。在本实验中，脂质为双层磷脂酰胆碱，溶于正癸烷中。将脂质以150微升氯仿溶液的形式分装于玻璃管内，于零下40摄氏度保存。从冰箱中取出一支玻璃管，待其升至室温后，在干燥氮气流下蒸发氯仿。在化学通风橱中，加入 50 微升末端烷烃并涡旋振荡。为了使双层膜形成溶液与用于形成双层膜的孔洞周围的聚四氟乙烯（Teflon）之间具有良好的接触，我们重新涂覆孔洞周围的聚四氟乙烯隔膜。首先，用 fch 清洁一支火焰抛光的巴斯德吸管。然后将清洗后的移液管浸入2.5%磷脂的正癸烷溶液中，使脂质上升约一毫米进入移液管内。将脂质滴加至聚四氟乙烯隔膜上的小孔处，形成一层薄膜。让脂质干燥约10到15分钟，然后重复上述操作。你好。今天，我们向您展示了如何为单通道实验制备脂双层膜。在配套的视频中，我们将向您演示如何分离微小的膜片、如何记录单通道电流活动、如何利用小分子调控通道活性，以及如何分析实验结果。好了，就到这里。感谢观看。祝您的实验顺利。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

电生理实验人工双层膜的制备

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使用聚二甲基硅氧烷薄膜自动形成脂双层膜

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本方案详细介绍了使用反馈温度控制加热系统促进高熔点脂质单层组装及液滴界面双层形成的实验方法，以及通过电容测量来表征温度驱动下膜结构变化的技术。...

温度控制下液滴界面双层膜的组装与表征

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。...

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

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本文介绍了一种实验方案，用于组装、电刺激并分析掺有短杆菌肽A的液滴界面双层膜。通过测量膜面积、离子流和单通道电导的变化，并将这些响应与受电突触启发的膜模型中类似可塑性的离子传导变化相关联，从而量化脂质-蛋白质的结构-功能关系。...

利用液滴界面双层膜表征脂质-蛋白质膜的结构与功能

学习制备平面脂质双层膜用于单通道电生理实验，使用Teflon隔室和玻璃微电极。该方法为离子通道研究提供可控环境，确保实验可重复性。

用于电生理实验的人工双层膜制备

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