固相合成
来源：Vy M. Dong 和 Diane Le，加利福尼亚大学欧文分校化学系，加利福尼亚州，美国
Merrifield 固相合成法是一项荣获诺贝尔奖的发明，该方法将反应分子固定在固相载体上，并通过连续的化学反应生成目标化合物。当分子固定在固相载体上时，可通过洗涤去除过量的试剂和副产物，而目标化合物…
1. 装填树脂
- 向一个100 mL的多肽合成反应瓶中加入2-氯三苯甲基氯（CTC）树脂（1.1 mmol/g，0.360 g，0.400 mmol）。加入20 mL DMF，并在N2气氛下溶胀30分钟。
- 在减压条件下滤除液体，并加入10 mL DMF。
- 加入500 mg Fmoc-Ala-OH（1.60 mmol）和2.5 mL i-Pr2EtN，在N2气氛下混合反应15分钟。
- 在减压条件下滤除溶剂，并用Fmoc-Ala-OH再次重复负载反应15分钟。
- 在减压条件下滤除溶剂，用10 mL DMF在N2气氛下洗涤树脂珠3次，每次均在减压下滤除液体。
2. Fmoc 基团的脱保护
- 加入 10 mL 含 20% 4-甲基哌啶的 DMF 溶液，在 N2 条件下搅拌树脂珠 15 分钟。
- 真空抽干溶剂，并重复脱保护步骤。
- 用 10 mL DMF 在 N2 条件下洗涤树脂珠，真空抽干，重复 3 次。
3. 进行 Kaiser 检验
- 进行茚三酮试验：向两支试管中分别加入1-2滴溶液A（0.5 mL 0.01 M KCN，24.5 mL 吡啶）、溶液B（1 g 茚三酮，20 mL n-丁醇）和溶液C（20 g 苯酚，10 mL n-丁醇）。其中一支试管作为对照，另一支用于监测反应。
- 从反应容器中取少量树脂珠加入反应试管中，并将两支试管加热至110 °C。
- 若脱保护完全，试管内溶液将变为深蓝色/紫色；若脱保护不完全或失败，溶液将保持黄色。将反应试管与对照试管进行比较。
4. 连接下一个结构单元
- 在真空条件下排干溶剂。
- 用10 mL缓冲液洗涤磁珠 NN₂ 保护下的甲基-2-吡咯烷酮2 在减压下除去溶剂。
- 开始下一轮偶联时，加入10 mL NMP、620 mg Fmoc-Phe-OH（1.6 mmol）、610 mg HBTU（1.6 mmol）和2.5 mLi-Pr2EtN，并让树脂在N₂下冒泡2 30 分钟。
- 在真空条件下排干溶剂。
- 用10 mL DMF在N₂氛围下洗涤磁珠2 并抽真空排液3次。
- 进行凯氏试验（参见步骤3.1-3.3）以检测偶联是否完成。试管中的珠粒与溶液应呈黄色。
5. 从树脂上裂解多肽
- 使用步骤 2.1–2.3 去除剩余的 Fmoc 保护基。
- 真空抽干溶剂后，向树脂中加入 40 mL 裂解液（95% TFA，2.5% H2O，2.5% TIPS），在 N2 气氛下鼓泡反应 3 小时。
- 在多肽合成仪上更换新的接收烧瓶，将含有目标多肽的 TFA 溶液在真空条件下转移至新烧瓶中。
6. 肽的沉淀与分离
- 将TFA溶液分装至4个锥形瓶中，向每个锥形瓶加入25 mL冷乙醚（−20 °C），以沉淀多肽。
- 离心锥形瓶（3,000 rpm，0–4 °C）20分钟。倾去残留的TFA和乙醚溶液，浓缩多肽沉淀，得到目标二肽白色固体。
固相合成是一种产物在与不溶性材料结合的同时进行合成的方法。
固相合成常用于制备生物寡聚物和聚合物，例如肽、核酸和寡糖。这些分子由较小的分子亚基（称为单体）连接而成。合成寡聚物或聚合物需要多个步骤，因为单体必须按正确的顺序依次加入。
多步合成的一个问题是，每一步反应中稳定产物（称为中间产物）的纯化和分离会降低总产率。在固相合成中，中间产物在整个合成过程中始终与固相载体结合。这使得液相试剂、溶剂和副产物可以通过洗涤去除，从而无需在各步骤之间对每个中间产物进行纯化和分离。
本视频将演示固相多肽合成的步骤，并介绍固相合成在化学领域的一些应用。
在固相合成中，分子在固相载体上通过一系列反应进行合成。例如，寡聚物或聚合物将逐个单体依次合成，最终形成目标产物。生长中的寡聚物或聚合物会牢固地结合在固相载体上，直到通过试剂将其从载体上分离（即裂解）为止。
每个单体必须至少具有两个结合位点才能参与聚合物链的形成，但每次只能有一个结合位点处于可用状态，以确保单体与正确的原子结合。这一目的通过保护基团实现，保护基团是在合成的一个或多个步骤中不发生反应的官能团。通过使用特定试剂处理分子，可将保护基团转化为具有反应活性的官能团，从而恢复或脱除保护，使结合位点重新暴露。
开始固相合成时，将起始物料通过其唯一的可结合位点连接到特制的树脂或不溶性聚合物上。随后，对已结合的起始物料进行脱保护，以使其能够与链中的第二个单体结合。接着，加入含有链中第二个单体的溶液，同时加入偶联试剂以促进单体之间的键合。
当第二个单体与起始材料结合后，所形成的二聚中间产物被脱保护。此过程重复进行，直至目标寡聚物或聚合物形成。产物从固相载体上切割并释放到溶液中，随后可进行纯化、分离和分析。
固相合成常用于合成肽，肽是由氨基酸连接而成的链状分子。氨基酸含有一个氨基、一个羧基和一个取代基（即“侧链”）。氨基最初处于保护状态，脱保护后，该氨基与下一个氨基酸的羧基反应形成肽键。
了解了固相合成的原理后，接下来我们将介绍固相多肽合成的一个具体操作流程，在该流程中将演示前两个氨基酸的添加过程。
开始实验操作时，将一个用于收集废液的接收瓶连接到100 mL手动多肽合成反应器上。然后将0.360 g的2-氯三苯甲基氯树脂加入该反应器中。将氮气管路连接至反应器的侧臂，将真空管路连接至锯齿形软管接头。
向树脂中加入 20 mL 二甲基甲酰胺，并在氮气氛围下使树脂珠溶胀 30 分钟。随后施加真空以除去溶剂。
向容器中加入10 mL DMF、1.6 mmol Fmoc保护的氨基酸和2.5 mL N,N-二异丙基乙胺。通入氮气鼓泡15分钟，使溶液混合，将保护的氨基酸负载到树脂上。
在减压条件下除去溶剂，并进行第二次上样。除去溶剂后，用10 mL的DMF分三次振荡洗涤负载的树脂珠，每次洗涤液均排入接收烧瓶中。
接下来，向已装填的树脂中加入 10 mL 含 20% 4-甲基哌啶的 DMF 溶液。通入惰性气体鼓泡反应 15 分钟，以去除 Fmoc 保护基团。
排干溶剂，并重复脱保护步骤。如前所述，用溶剂洗涤负载树脂三次，并排干。将树脂珠保存在溶剂中，直至准备进行下一步操作。
为了验证加载的化合物是否完全去保护，首先在两支试管中分别加入1至2滴每种凯撒试验溶液。
取少量已负载的珠子放入试管中，将两支试管置于油浴中加热至110摄氏度。若树脂混合物变为深蓝色至紫色，表明混合物中存在氨基，即脱保护完成。
开始偶联步骤时，首先在氮气流下用 10 mL NMP 清洗磁珠。
然后，向负载的树脂中加入 10 mL NMP、1.6 mmol 的下一个 Fmoc 保护氨基酸、1.6 mmol 偶联试剂 HBTU 以及 2.5 mL DIPEA。
将 N2 气体通入树脂混合物中鼓泡 30 分钟，然后排去溶剂。用 10 mL 的 DMF 分部洗涤树脂珠三次，每次均洗涤后排液，操作同前。
重复进行凯撒试验。如果珠子和溶液变为黄色，表明没有胺基存在，说明偶联已成功。
接下来，用含20% 4-甲基哌啶的DMF溶液切除新的Fmoc保护基，随后用10 mL DMF分次洗涤树脂珠。针对目标肽中剩余的每个氨基酸，重复进行偶联与脱保护步骤。
最后一个氨基酸脱保护并洗涤树脂珠后，加入 40 mL 肽裂解溶液，以将肽产物从树脂上分离。
将氮气通入树脂混合物中鼓泡3小时，然后更换接收瓶。在减压条件下，将树脂混合物中的溶液转移至新的接收瓶中。
为了获得最终产物，使用旋转蒸发仪除去溶剂。
固相合成在生物学和化学领域被广泛应用。让我们来看几个例子。
固相合成技术为寡糖（即具有重要生物学功能的简单单糖短链，如能量储存）的合成开辟了许多新的合成途径。与肽键不同，糖单元之间的每一个化学键都含有一个立体中心。因此，合成寡糖时不仅需要单体按正确顺序连接，而且各糖键还必须具有正确的立体化学构型。为此发展了固相合成技术，通过高度立体选择性的过程将每个单体依次偶联，如今该技术已足够成熟，可实现自动化。
固相合成是组合化学中常用的一种方法，组合化学是指在单个合成过程中合成一种化合物的多种变体。负载树脂可轻松分装成若干份，分别与不同的单体或分子反应。每次反应后，各份树脂经过洗涤再重新合并。此过程重复进行，直至生成所需数量的产物。该技术在药物研究中尤为有用，可用于生成新化合物，或评估一种化合物与大量不同分子的反应活性。
您刚刚观看了 JoVE 关于固相合成的简介。现在，您应该理解了固相合成的基本原理、固相多肽合成的操作步骤，以及固相合成在有机化学中应用的几个实例。感谢观看！
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Q1: Why is solid phase synthesis better than traditional multi-step synthesis?
Solid phase synthesis improves overall yield by eliminating intermediate purification steps. Since the product remains bound to the solid support throughout synthesis, solution-phase reagents, solvents, and byproducts can be washed away without isolating each intermediate product. This streamlined approach saves time and increases efficiency in synthesizing oligomers and polymers.
Q2: What role do protecting groups play in solid phase synthesis?
Protecting groups are functional groups that remain unreactive during specific synthesis steps, ensuring monomers bind to the correct atom. Each monomer requires two binding sites but only one can be available at a time. Protecting groups are removed through deprotection, converting them back to reactive functional groups and allowing the next monomer to attach in the correct sequence.
Q3: How does the Kaiser test verify successful deprotection in peptide synthesis?
The Kaiser test detects amine groups present on resin beads after deprotection. When heated with Kaiser reagent solutions, a dark blue to purple color indicates complete deprotection and the presence of free amine groups. If coupling has occurred successfully, the beads turn yellow, showing no amine groups remain available for further reaction.
Q4: What are the main steps in solid phase peptide synthesis?
Solid phase peptide synthesis involves binding an amino acid to resin, then repeatedly deprotecting the amine group, coupling the next amino acid using a coupling agent, and washing away byproducts. After all amino acids are added in sequence, the peptide is cleaved from the resin with cleavage solution and purified. This cyclical process ensures amino acids attach in the correct order.
Q5: How is solid phase synthesis applied in combinatorial chemistry?
In combinatorial chemistry, loaded resin is split into portions that react with different monomers or molecules. After each reaction, portions are washed and recombined, repeating until many product variants are generated. This technique is valuable in pharmaceutical research for synthesizing new compounds and evaluating how a compound reacts with diverse molecules efficiently.
Q6: Why is solid phase synthesis particularly useful for synthesizing oligosaccharides?
Oligosaccharides require monomers in correct order and bonds with precise stereochemistry. Solid phase synthesis techniques enable highly stereoselective coupling of each sugar monomer, controlling stereochemistry at each bond. These methods are refined enough to be automated, making solid phase synthesis ideal for producing complex oligosaccharides with biological roles like energy storage.
Q7: What happens after the final peptide product is cleaved from the resin?
After cleavage with peptide cleavage solution, the peptide product transfers to a new receiving flask under vacuum. The solvent is then removed using a rotary evaporator to generate the final product. This purification step isolates the synthesized peptide from the resin and other impurities for analysis and characterization.