固相合成

1. 装填树脂

1. 向一个100 mL的多肽合成反应瓶中加入2-氯三苯甲基氯（CTC）树脂（1.1 mmol/g，0.360 g，0.400 mmol）。加入20 mL DMF，并在N₂气氛下溶胀30分钟。
2. 在减压条件下滤除液体，并加入10 mL DMF。
3. 加入500 mg Fmoc-Ala-OH（1.60 mmol）和2.5 mL i-Pr₂EtN，在N₂气氛下混合反应15分钟。
4. 在减压条件下滤除溶剂，并用Fmoc-Ala-OH再次重复负载反应15分钟。
5. 在减压条件下滤除溶剂，用10 mL DMF在N₂气氛下洗涤树脂珠3次，每次均在减压下滤除液体。

2. Fmoc 基团的脱保护

1. 加入 10 mL 含 20% 4-甲基哌啶的 DMF 溶液，在 N₂ 条件下搅拌树脂珠 15 分钟。
2. 真空抽干溶剂，并重复脱保护步骤。
3. 用 10 mL DMF 在 N₂ 条件下洗涤树脂珠，真空抽干，重复 3 次。

3. 进行 Kaiser 检验

1. 进行茚三酮试验：向两支试管中分别加入1-2滴溶液A（0.5 mL 0.01 M KCN，24.5 mL 吡啶）、溶液B（1 g 茚三酮，20 mL n-丁醇）和溶液C（20 g 苯酚，10 mL n-丁醇）。其中一支试管作为对照，另一支用于监测反应。
2. 从反应容器中取少量树脂珠加入反应试管中，并将两支试管加热至110 °C。
3. 若脱保护完全，试管内溶液将变为深蓝色/紫色；若脱保护不完全或失败，溶液将保持黄色。将反应试管与对照试管进行比较。

4. 连接下一个结构单元

1. 在真空条件下排干溶剂。
2. 用10 mL缓冲液洗涤磁珠 NN₂ 保护下的甲基-2-吡咯烷酮₂ 在减压下除去溶剂。
3. 开始下一轮偶联时，加入10 mL NMP、620 mg Fmoc-Phe-OH（1.6 mmol）、610 mg HBTU（1.6 mmol）和2.5 mLi-Pr₂EtN，并让树脂在N₂下冒泡₂ 30 分钟。
4. 在真空条件下排干溶剂。
5. 用10 mL DMF在N₂氛围下洗涤磁珠₂ 并抽真空排液3次。
6. 进行凯氏试验（参见步骤3.1-3.3）以检测偶联是否完成。试管中的珠粒与溶液应呈黄色。

5. 从树脂上裂解多肽

1. 使用步骤 2.1–2.3 去除剩余的 Fmoc 保护基。
2. 真空抽干溶剂后，向树脂中加入 40 mL 裂解液（95% TFA，2.5% H₂O，2.5% TIPS），在 N₂ 气氛下鼓泡反应 3 小时。
3. 在多肽合成仪上更换新的接收烧瓶，将含有目标多肽的 TFA 溶液在真空条件下转移至新烧瓶中。

6. 肽的沉淀与分离

1. 将TFA溶液分装至4个锥形瓶中，向每个锥形瓶加入25 mL冷乙醚（−20 °C），以沉淀多肽。
2. 离心锥形瓶（3,000 rpm，0–4 °C）20分钟。倾去残留的TFA和乙醚溶液，浓缩多肽沉淀，得到目标二肽白色固体。