纳米药物载体的生物分布:SEM的应用

金属和磁性纳米颗粒被广泛用作药物递送的纳米载体。它们在组织中的生物分布对于评估其治疗效果和安全性至关重要。纳米载体是亚微米颗粒，通常限制在 200 纳米以下，可以加载治疗剂。由于它们的大小，它们能够进入体内的许多部位和器官。颗粒最终进入体内的位置（称为其生物分布）是用于评估安全性、优化剂量和改善药物靶向的重要参数。

在本视频中，将描述靶向药物递送的基本原理，并演示使用高分辨率成像技术评估生物分布的方法。还将讨论基于纳米粒子的载体的其他应用。

让我们从讨论纳米颗粒的基本原理开始，并了解为什么它们被开发为药物载体。

首先，纳米级颗粒可以是聚合物、脂质体或金属，通常具有生物相容性，这意味着它们对活组织无害或反应性，也不会引起免疫反应。然而，必须进行纳米毒理学研究，以了解材料和粒径如何影响体内的生物分布。

其次，它们的小尺寸允许它们通过炎症部位（例如肿瘤）的内皮外渗，并导致细胞的有效摄取。随着癌细胞的分裂，需要血管供应来提供营养和氧气并支持肿瘤生长。这些血管形成迅速，因此通常是异常和有效的，其内皮内层包含大间隙，导致脉管系统渗漏和通透性增加。然后，纳米颗粒能够从血液中逸出并在肿瘤微环境中积累。这称为被动靶向，其中纳米载体通过称为 EPR 效应或增强渗透性和保留效应的现象到达靶器官。

最后，这些纳米颗粒具有较大的表面积，可以用抗体或蛋白质等特异性配体进行功能化。在主动靶向中，这些配体可以识别并结合肿瘤部位细胞过表达的受体。纳米载体表面的配体与细胞受体之间的特异性相互作用触发受体介导的内吞作用并促进细胞摄取。

现在我们已经了解了纳米颗粒药物递送的基础知识，让我们看一个使用高分辨率成像来确定金属纳米颗粒在小鼠模型中的生物分布的演示。

首先，准备将注射到小鼠中的纳米颗粒。这里使用了 30 纳米的钡和钛颗粒。小鼠麻醉后，通过尾静脉静脉注射纳米颗粒。让鼠标恢复，同时它们在 1 周、4 周和 8 周内被动地瞄准器官。

在适当的注射后时间点，根据 AVMA 指南对小鼠进行人道安乐死。然后打开体腔，通过手术切除感兴趣的器官，如脾、肾、肝和肺。并将器官储存在 10% 磷酸盐缓冲的福尔马林中直至分析。

现在使用镊子将小鼠组织从固定剂转移到磷酸盐缓冲盐水中。摇动样品 30 分钟，每 10 分钟更换一次 PBS，以去除多余的固定剂。然后从摇床中取出组织。将含有水溶性乙二醇和树脂的最佳切割温度化合物添加到标记的塑料模具中。

用 Kimwipe 擦干纸巾，然后将其放入塑料模具中。用覆盖组织的 OCT 化合物填充模具，然后放入塑料袋中。将袋子放入装有干冰的桶中，然后移至零下 80 摄氏度的冰箱中过夜。

第二天，将样品从冰箱中取出并放在干冰上，然后运送到低温恒温器。将腔室温度设置为零下 23 度，然后将样品转移到低温恒温器上。用您要切片的样品的器官类型和纳米颗粒大小标记载玻片。然后激活低温恒温器。接下来用 OCT 覆盖低温恒温器卡盘。然后从模具中取出样品并将其放在卡盘顶部。将卡盘安装到样品架上，并调整方向和调整，以便刀片直接切割冷冻样品。现在将样品靠近刀片，并将厚度设置为 30 微米以进行粗面加工。旋转手轮切片 30 微米厚的切片，然后继续切片，直到切出均匀的组织切片。对于精细饰面，将切片厚度设置为 7 到 8 微米，然后对样品进行切片。

通过在切片上按压标记的载玻片来收集切片。然后将玻片添加到架子上，并在室温下风干。干燥后，将玻片架反复浸入 50% 乙醇中 3 分钟以去除 OCT。将玻片架转移到 80% 乙醇中并浸泡 3 分钟。然后将冻存架移至冷甲醇与丙酮的 1：1 比例，并放入零下 20 摄氏度的冰箱中。10 分钟后，从冰箱中取出玻片架，用纸巾沥干。干燥后，将载玻片放入载玻片盒中，并在零下 20 摄氏度下储存直至使用。

现在让我们对注射后一周用 30 纳米钡和钛颗粒收集的小鼠肺组织进行成像，以确定它们的生物分布。首先，首先将准备好的载玻片安装到 SEM 载物台上。要了解如何溅射涂层和制备样品，请观看此集合中的上一个视频。然后将载物台加载到 SEM 室中。一旦样品进入视野，将样品垂直移动到大约 5 毫米的工作距离。打开电子束并选择二次电子的检测器。然后将光束加速电压设置为 25 千电子伏特。要开始成像，请将样品放大到大约 1,000 至 2,000 倍的放大倍数。在此放大倍率下，即使纳米颗粒不可见，包含纳米颗粒的结构也应该是可见的。这称为次映像。

现在使用 SEM 模块中的反向散射电子检测模式来可视化纳米颗粒。沿 Z 方向移动载物台以获得与上面相同的 5 毫米工作距离。调整反向散射检测器的配置，并为检测面板使用不同的电压偏置，直到图像清晰。高对比度区域，即纳米颗粒，现在应该可见了。这是反向散射图像。捕获并保存图像。

接下来，获得样品的能量色散 X 射线光谱或 EDS 数据。放大一团纳米颗粒的高对比度区域。然后打开腔室中的第二个摄像头，将 EDS 降低到系统中。观察摄像头屏幕以确保 EDS 接近，但不接触 BSD 或电子枪。然后打开微量分析软件并获取图像。使用鼠标选择感兴趣的区域以进行进一步分析。然后显示该区域的 X 射线光谱。这里的峰代表钡和钛，证实了样品中存在金属纳米颗粒。现在打开定性数据分析软件并绘制载玻片上器官的边界。然后从菜单中选择并运行适当的方案，以创建器官的马赛克图像。这可能需要几个小时。

完成后，将其导出为 TIF 文件并在 ImageJ 中打开该文件。调整对比度阈值以突出显示对比度非常高的区域，即纳米颗粒。然后选择 Analyze Particles 以获得器官中纳米粒子的平均数量以及包含纳米粒子的器官的面积百分比。

对来自其他时间点和器官的剩余组织样品重复此过程中的所有步骤。收集完所有数据后，将其编译成生物分布图。

现在让我们分析图像以确定生物分布并了解身体如何处理纳米颗粒。首先，将测得的颗粒分布绘制为分析所有样品的时间函数。这是 30 纳米尺寸纳米颗粒在各种小鼠器官中的随时间分布。八周后纳米颗粒总体减少，这表明纳米颗粒从体内清除。

然而，4 周后肝脏中的纳米颗粒浓度增加。这表明身体可能正在将本研究中使用的 30 纳米钡和钛纳米颗粒作为毒素进行处理。还可以进行这种分析来评估纳米颗粒的大小如何影响其在体内的生物分布。改变纳米颗粒的大小会影响整体细胞摄取速率和清除率。

纳米颗粒和纳米载体广泛用于生物医学研究，并可用作成像、诊断和治疗剂。纳米颗粒正在开发用于针对各种传染病的疫苗递送，因为它们可以保护疫苗成分免于降解并最大限度地激发免疫刺激。正在开发用于诱导抗原特异性 CD8 阳性 T 细胞反应的双层交联多层囊泡 （ICMV）。

这些 ICMV 特异性定位于小鼠的淋巴结中，以实现高效的疫苗递送，并引发了针对疟疾抗原和肿瘤细胞的强大免疫反应。金属纳米颗粒在磁共振成像中通常用作造影剂，以可视化组织结构和功能，以便早期发现疾病。氧化铁纳米颗粒是有用的诊断探针。当与双膦酸盐部分合成时，这些纳米颗粒迅速、选择性地积聚在动脉粥样硬化斑块中，并允许在一小时内看到它们以进行快速诊断。

最近，负载纳米载体已被开发为一种同时检测早期癌症和递送化疗药物的策略。这些纳米载体被称为治疗诊断学，因为它们集成了诊断和治疗能力。

您刚刚观看了 JoVE 关于确定纳米药物载体生物分布的视频。您现在应该了解纳米药物载体的基本原理，如何使用高分辨率 SEM 检测组织样本中的纳米载体，并确定它们的生物分布，以及纳米颗粒在生物医学工程中的一些应用。

感谢观看。