纳米药物载体的生物分布：扫描电镜的应用

1. 纳米颗粒注射与器官采集

1. 将纳米颗粒通过静脉注射注入麻醉小鼠体内，以实现被动靶向。
2. 在预定时间点（即注射后1、4和8周），根据美国兽医协会（AVMA）指南对小鼠实施人道安乐死。
3. 打开体腔并手术取出目标器官。将器官置于聚丙烯容器中的10%磷酸盐缓冲甲醛溶液中，直至进行样本处理。

2. 组织样本制备

1. 使用镊子将小鼠组织从固定液转移至磷酸盐缓冲液（PBS）中，振荡30分钟，每10分钟更换一次PBS。
2. 取出组织，用无尘纸（kimwipe）吸干，然后将其放入含有最佳切割温度包埋剂（OCT）的塑料模具中，于-80 °C过夜保存。
3. 次日，将样品转移至冷冻切片机，并将温度设定为-23 °C。
4. 在载玻片上标记器官类型和纳米颗粒尺寸，并将其放置在冷冻切片机内的架子上。
5. 在冷冻切片机持样器（chuck）上覆盖OCT，将样品置于其上，放下提取器活塞压住样品，静置3–5分钟使其平衡。
6. 将持样器安装到样品架上，并调整方向，使刀片能够垂直于冻结样品进行切割。将样品移近刀片进行粗切，设定切片厚度为30 μm，连续切片数次，直至获得平整均匀的切面。
7. 将切片厚度调至7–8 μm进行精细切面。用标记好的玻璃载玻片轻压切片以收集样本，每张切片上放置两张载玻片，随后存入载玻片架中，室温下自然干燥。
8. 干燥后，将载玻片架浸入50%乙醇中3分钟以去除OCT，随后转移至80%乙醇中3分钟，再将载玻片架放入-20 °C的冷甲醇与丙酮1:1混合液中处理10分钟。
9. 取出载玻片架，用纸巾吸去多余溶剂，20–30分钟后将载玻片放入片盒中，于-20 °C冰箱中保存，待成像时使用。

3. 使用扫描电镜和能谱仪进行高分辨率成像

1. 按照“生物样品的扫描电镜成像”中的描述制备样品，然后将样品装入扫描电镜中。
2. 打开扫描电子显微镜（SEM），将工作距离调整至约 5 mm，加速电压和束流均设为 25 keV。该参数通常对生物样品而言过高，但由于样品已进行导电性镀膜处理并受到保护，因此适用。
3. 开始成像，并将放大倍数调整至约1,000–2,000倍，以观察可能含有纳米颗粒的结构。注意，若无背散射检测器（BSD），则无法在一定深度以下区分这些结构。
4. 在相同参数下插入BSD，并沿z方向移动载物台，使其工作距离与之前一致。
5. 以大致相同的放大倍数开始成像，并确认在存在纳米颗粒的情况下能够观察到高对比度。保存图像。
6. 使用不同的BSD配置（使探测器上的电荷对齐），选择能显示纳米颗粒最高对比度的配置。
7. 放大观察显示单个纳米颗粒或成团纳米颗粒的高对比度区域。
8. 打开 2^nd 按下扫描电镜附件的向下按钮，将能谱仪（EDS）插入系统，同时通过腔室的摄像头观察。当能谱仪接近但尚未接触背散射探测器（BSD）或电子枪时，松开按钮。
9. 在EDS计算机（仍位于工作站）上打开Aztec程序，并从扫描电镜（SEM）获取图像。使用“点击即采集”（point and shoot）方法，点击对比度高且富含纳米颗粒的区域。 
10. EDS 将显示该点的特征X射线谱。观察图谱上是否同时出现钡和钛的峰，以确认所观察到的确实是纳米颗粒，而非任何类型的污染物。 
11. 返回样本，使用 Atlas 软件在切片上绘制器官的边界。选择“Organ”（器官）协议以创建该区域的拼接图像，并运行程序（最多需要数小时）。 
12. 软件生成并拼接复合图像后，将其导出为 Tif 文件。 
13. 在 ImageJ（一款开源软件）中打开 Tif 文件，调整对比度阈值以突出显示高对比度区域（即纳米颗粒）。使用 Organ 方案中定义的像素尺寸（约为 100 nm）和内置功能来定量分析纳米颗粒的体积。 
14. 尽管本实验步骤仅针对小鼠肺组织的1周样本，但需对其他周数及其他器官的样本重复执行该步骤，以汇总绘制出分布图。
15. 在计算每周各器官的生物分布后，生物分布图将显示8周内纳米颗粒在各器官中分布情况及浓度的变化。这些图示可反映纳米颗粒的峰值浓度，并提供其从器官中清除所需时间的相关信息。