生物样品的扫描电镜成像

1. 样品制备

1. 操作样品时请佩戴手套，并采取预防措施避免污染。
2. 确保载玻片上的样品已完全干燥，且样品无污染。因为扫描电镜（SEM）用于表面表征，这些缺陷会严重干扰信号。
3. 若样品置于标准玻璃载玻片上，可用金刚石刀头玻璃切割器沿直线划痕，然后轻轻远离身体方向施压，使玻璃沿划线处断裂，从而减小样品尺寸。
4. 根据样品性质，选择与样品元素组成不同的镀层材料（避免干扰能谱仪EDS的信号接收）。本演示中采用金-钯镀层。
5. 按照溅射镀膜仪的操作说明进行操作，溅射时间约为40秒，以获得厚度均匀且覆盖充分的薄层镀膜。
6. 使用导电双面碳胶带将样品固定在SEM样品台上。若样品载于非导电载玻片上，应从样品台延伸碳胶带至溅射处理过的载玻片顶部，以实现接地。也可使用一层薄导电银漆增强样品与样品台之间的导电性。
7. 将样品台安装到载物台上，并拧紧侧面的固定螺丝。

2. 成像步骤

1. 将样品台装入腔室，关闭并密封舱门，然后点击 "Transfer" 按钮，打开从装载腔室通往真空腔室的通道。
2. 当 Transfer 按钮停止闪烁且内部舱门打开后，可通过旋入金属杆并将样品推入腔室的方式，将样品移入真空腔室。
3. 旋下金属杆，将其完全缩回并固定在装载腔室内，然后按下 "store" 按钮，使装载腔室与真空腔室隔离。此时样品已装载完毕，后续所有操作均通过计算机工作站完成。
4. 使用控制器并打开样品台导航面板，移动样品台，直至其进入视野范围。
5. 垂直移动样品，使工作距离保持在 5–10 mm。在沿 z 方向移动样品台时，开启腔室摄像头，确保样品不会过于接近电子枪。
6. 开启超高张力（EHT）电子束。注意：若电子光学柱已关闭较长时间，可能还需手动打开柱阀。
7. 从探测器选项中选择 SE2 信号。
8. 初始成像时使用约 5 kV 的加速电压设置，随后在背散射模式下将电压提高至 20–30 kV 以获得更强信号。若样品 未 进行镀膜处理，应保持较低的 keV 值，以避免图像中出现过多电荷积累伪影，并防止样品受损。
9. 若未获得清晰图像，调节聚焦、亮度和对比度旋钮，直至可见结构出现，以此作为后续优化的参考。
10. 先在粗调模式下旋转聚焦旋钮，直至图像可见，然后切换至微调模式以获得最佳聚焦效果。
11. 利用样品台导航（非 z 方向）和放大倍数调节，寻找合适的区域以保存图像。
12. 降低扫描速度并开启线平均功能，以获取质量更优的图像用于保存。
13. 通过右键单击并将图像保存至指定文件路径来完成图像保存。
14. 插入背散射探测器（BSD），并将样品台移回样品清晰聚焦的 z 位置。
15. 重复步骤 8 至 11，寻找显示较高原子序数的对比区域。
16. 完成操作后移除背散射探测器（BSD）。
17. 准备取出样品时，按下 "exchange" 按钮。
18. 将样品移回装载腔室，依次点击 "store" 和 "vent" 按钮。