流细胞学和荧光活化细胞分拣（FACS）:血性B淋巴细胞的分离

免疫系统通过产生白细胞（也称为白细胞）来保护身体免受病原体的入侵。当病原体成功感染生物体时，各种各样的白细胞被激活，这种协调反应称为免疫反应。

通常，研究人员能够识别响应病原体而被激活的免疫细胞的特定类型和数量是有用的。流式细胞术是一种允许研究人员根据细胞表面表达的特定表位来分离细胞的技术。这是使用与已知免疫细胞特异性表位结合的荧光染料标记的单克隆抗体实现的，激发后，这些结合的荧光染料发出波长的光，该波长可以通过流式细胞仪进行检测和评分。

流式细胞仪由三个系统组成。流体系统以流的形式运输细胞，使它们一个接一个地通过激光前面。光学系统由激光器和检测器组成，可识别荧光团的存在与否。最后，电子系统将收集到的光学数据转换为电子文件进行分析。

流式细胞术的扩展是荧光激活细胞分选仪 （FACS），它允许富集特定细胞群，以便可以独立研究它们。细胞分选是使用液流中的振动喷嘴完成的，该喷嘴形成微液滴，每个微液滴包含一个细胞。然后，检测器确定每个液滴是否发出荧光，并根据该信息，电磁铁为每个细胞带负电荷或正电荷。接下来，强电场将带不同电荷的液滴分选到单独的容器中。最终，其中一个容器将包含基于特定细胞表面分子表达的同质细胞群。

在本视频中，您将学习如何使用流式细胞术从小鼠脾脏组织中分离白细胞，并使用 FACS 来选择 B 淋巴细胞。

首先，戴上实验室手套和适当的防护服。接下来，先用清洁剂清洗一把解剖剪刀和镊子，然后用 70% 乙醇清洗，然后用干净的纸巾擦干。

然后，将 49 毫升 Hank's 平衡盐溶液 （HBSS） 添加到 50 毫升试管中。加入 1 毫升胎牛血清或 FCS 以制备 HBSS 2% FCS 溶液，并通过轻轻上下移液约 10 次进行混合。

接下来，将安乐死的小鼠仰卧位放在解剖板上。用剪刀和镊子进行纵向剖腹手术以进入腹腔。使用镊子将腹部右侧的肠道移至一侧，露出胃和脾脏。脾脏附着在胃上。然后，用移液管将 5 毫升 HBSS 2% FCS 放入培养皿中。使用镊子小心地将脾脏从胃中分离出来，然后将脾脏放入培养皿中。

为了分离免疫细胞，首先将脾脏放在培养皿中的 40 微米细胞过滤器上。用柱塞压碎脾脏，使其解离到培养皿中。然后，将分离的脾脏和液体从培养皿中移液到 15 毫升离心管中。在 10 摄氏度下以 370 倍 g 离心管 7 分钟，然后小心取出管子，以免干扰沉淀。

现在，去除上清液，避免沉淀，并将液体丢弃在适当的废液容器中。然后，将 2 毫升 ACK 裂解缓冲液加入离心管中，以重悬和裂解红细胞。等待 2 分钟，然后加入 HBSS 2% FCS，获得 15 毫升的总体积。重复离心。小心地取回试管并丢弃上清液。再次将沉淀重悬于 5 毫升 HBSS 2% FCS 中。

要对重悬的细胞进行计数，请用 5 μL 台盼蓝稀释 5 μL 细胞悬液。然后，在盖玻片和 Malassez 载玻片之间轻轻滴入 5 微升这种稀释的细胞悬液。现在，在显微镜下以 40 倍放大倍数计算存在的细胞数。然后，通过添加适当体积的 HBSS 2% FCS，将细胞浓度调整为每毫升 10 至第七个细胞。

要对免疫细胞进行染色，首先从 1 到 6 标记 6 个 FACS 管。然后，将 200 微升细胞溶液转移到六个试管中。将这些试管在 10 摄氏度下以 370 g 离心 7 分钟，然后去除上清液。

然后，将 6 个新的 FACS 管标记为 1 到 6，并将 200 微升 HBSS 2% FCS 移液到每个管中。根据表 1，向每个试管中加入适量的抗体，制备六种新型抗体混合物。Mix 1 适用于未染色的细胞，不添加抗体。混合物 2 到 5 分别包含不同的单抗体，用于补偿设置。Mix six 包含用于分选的多重染色细胞的所有四种抗体。

接下来，将这些抗体混合物转移到相应的编号 FACS 管中。将这些溶液在 4 摄氏度下或在黑暗中的冰上孵育 20 分钟。接下来，向每个试管中加入 1 毫升 HBSS 2% FCS，然后再次离心。弃去上清液，然后将沉淀重悬于 200 微升 HBSS 2% FCS 中。最后，将重悬的沉淀转移到新标记的 FACS 管中。

要执行 FACS，请先打开排序器。然后，选择 Cytometer（细胞仪）菜单并单击 fluidics startup（液流启动）。按照屏幕上的说明进行作。

在 stream（流）选项卡上，单击红叉以打开流，然后等待 15 分钟以使流稳定下来。调整流的振幅，直到您在 Stream （流） 选项卡上看到一个清晰的分离液滴。然后，点击 最佳点 完成振幅调整。将 Neutral Density （ND） 滤镜 1.0 插入激光器前面。

打开屏幕顶部的细胞仪菜单，然后选择 CST，它代表 Cytometer Setup and Tracking（细胞仪设置和追踪）。为了进行日常质量控制，首先按照制造商的说明在 FACS 管中用 FACS 培养基稀释 CST 珠子。然后，将试管装入机器中，并通过单击 CST 选项卡上的运行来执行 CST 控制。

CST 控制完成后，将细胞仪上的 ND 1.0 滤光片替换为 ND 2.0 滤光片。接下来，按照制造商的说明在 FACS 培养基中稀释滴延迟珠，然后将试管加载到 FACS 中。为确保正确排序，请先单击 voltage 然后单击 optical filter 来执行 drop delay。滤光片的右象限应等于 100%，表示机器记录了 100% 的液滴。如有必要，向左或向右调整细胞仪上的红色激光螺钉，以获得右象限的 100%。确保液流落入收集管非常重要。为此，请单击 waste drawer ，然后单击 test sort 来执行测试排序。检查侧流是否落入收集管中。如果没有，请调整排序选项卡下的电压，直到他们这样做。

通过选择浏览器选项卡并单击共享视图导航到实验模板。然后，打开 Accudrop_DROP DELAY 实验并单击排序布局按钮。现在，通过纵流量直到达到每秒 3,000 个事件来更改客户获取控制面板上的阈值速率。单击 voltage，然后单击 optical filter。左象限应等于 0，右象限应等于 100。

最后，在排序布局窗口中，单击 sort，然后单击 cancel。左象限应等于 100，右象限应等于 0。如果左象限小于 95，请单击 auto delay 以指示软件自动增加电压以获得左象限 100% 的压降。

首先，我们将使用未染色的细胞来定义细胞形态和荧光染料的负峰。为此，将包含未染色细胞的试管 1 放入机器中，然后在采集仪表板选项卡下单击加载。在 Cytometer （细胞仪） 选项卡中，调整前向和侧向散射电压，直到您在屏幕上看到细胞群是密集的点。淋巴细胞是小细胞，因此它们将具有低的前向散射和低侧向散射。

接下来，通过在细胞仪选项卡中调整荧光染料的电压来去除背景荧光，直到负水平的细胞群处于全局工作表选项卡中的第一个十年。在细胞仪菜单中，单击查看配置并验证所有荧光染料都存在。接下来，将 2 号试管放入细胞仪中，然后单击 load。调整细胞仪选项卡中的光谱重叠，直到阴性和阳性群体中位数在全局工作表选项卡中对齐。在 acquisition 选项卡上，将 events to record 参数设置为 10,000，然后单击 record。对 3 号、4 号和 5 号管重复这些步骤。

接下来，加载包含多重染色细胞的试管 6。要分离 B 淋巴细胞，首先设置参数以根据细胞的形态对细胞进行分类。在第一个窗口中，在 y 轴上绘制 FSC-A 前向散射区域，在 x 轴上绘制 SSC-A 侧向散射区域。在散点图中，每个点代表一个单元格。单击全局工作表上的多边形门，然后选择具有低前向散射和中间侧向散射的群体。在新的点图窗口中，右键单击该窗口并从菜单中选择 show populations ，然后单击 P1。

然后，在新窗口中，通过在 y 轴上绘制活力，在 x 轴上绘制 CD45 来设门活的 CD45 阳性细胞。使用多边形门圈出活力低、CD45 信号高的细胞，并选择 P2 在新窗口中显示所选细胞。在下一个窗口中，CD45 阳性白细胞的门控，不包括 T 淋巴细胞。CD45 在 x 轴上，CD3 在 y 轴上，圈出具有高 CD45 信号和低负 CD3 信号的群体，然后选择 P3。最后，对识别 B 淋巴细胞的 CD19 阳性细胞进行设门。CD19 在 y 轴上，CD3 在 x 轴上，圈出具有高 CD19 信号和低负 CD3 信号的群体，然后选择 P4。

现在，所有排序参数都已设置完毕。接下来，在分选布局窗口中，选择您感兴趣的细胞群 - P4，这是设门的第四个细胞群，并告诉机器仅对 B 淋巴细胞进行分选。将目标事件设置为 10,000 个细胞，并将精度设置为纯度。我们只对一个群体进行排序。但是，最多可以同时对四个不同的群体进行排序。准备好后，单击 排序 和 OK.然后，等待单元格分选。

细胞分选完成后，通过将 10 微升分选的细胞移液到含有 90 微升 HBSS 2% FCS 的新 FACS 管中进行纯度控制。将试管放入细胞仪中，单击"加载"，然后单击"记录"以分析细胞的表型，以验证门控策略是否按预期工作。

现在，我们将分析分选的细胞以确定从小鼠脾脏中分离的白细胞中 B 淋巴细胞的百分比。首先，双击 FlowJo 图标并将每个试管的文件拖到 all sample 窗口中。

单击 polygon 并重新创建上一节中使用的门控策略。接下来，单击布局编辑器，将感兴趣的 B 淋巴细胞群从试管 6 和纯度对照拖动到布局编辑器选项卡中。将出现代表 B 淋巴细胞的点图。在此示例中，右上角的图表示从总脾细胞悬液中分选的 B 淋巴细胞，右下角的图是纯度对照。细胞应仅出现在纯度对照中感兴趣的群体中。

要检查分选细胞中 B 淋巴细胞的纯度，请单击表格编辑器。从试管 6 和纯度对照中拖动 B 淋巴细胞群到表中。在统计菜单上，选择 CD45 阳性细胞的频率以测试该细胞群的纯度。然后，单击 create table。参数值将显示在新表中。在纯度控制窗口中，检查 CD45 阳性细胞内 B 淋巴细胞的频率，应高于 98%。