流式细胞术与荧光激活细胞分选（FACS）：脾脏B淋巴细胞的分离

1. 准备

1. 开始前，戴上实验室手套及适当的防护服。
2. 先用洗涤剂，再用70%乙醇对所有解剖工具进行灭菌，然后彻底干燥。
3. 准备含有2%胎牛血清（FCS）的50 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）。

2. 解剖

1. 使用二氧化碳输送系统，通过缺氧法处死小鼠。将已处死的小鼠仰卧固定在解剖板上，用剪刀和镊子进行纵向腹腔切口。
2. 用镊子将肠道和胃向腹部右侧移动，以暴露胃和脾脏。脾脏与胃相连。
3. 用镊子小心地将脾脏从胃部分离，并将其放入含有5 mL HBSS 2% FCS的培养皿中。

3. 免疫细胞分离

1. 将脾脏置于同一培养皿上的40µm细胞筛网上，用研杵碾压脾脏，使其在同一个培养皿中解离。
2. 将解离后的脾脏组织和液体转移至15mL离心管中。
3. 在10°C条件下以370 × g 离心7分钟，弃去上清液，注意避免扰动沉淀。
4. 用2mL醋酸钾重悬沉淀，以裂解红细胞。静置2分钟后，加入HBSS 2% FCS至总体积达15mL。
5. 再次在10°C条件下以370 × g 离心7分钟，弃去上清液，并用5mL HBSS 2% FCS重悬沉淀。
6. 使用台盼蓝染色法计数细胞，并用适量体积的HBSS 2% FCS将细胞浓度调整至10⁷ 个细胞/mL。

4. 细胞染色

1. 将200µL细胞悬液转移至六支已标记为1至6的FACS管中。
2. 在10°C条件下，以370 × g 离心7分钟，弃去上清液，注意保留沉淀。
3. 接下来，根据表1，将适量抗体加入200µL HBSS 2% FCS中，配制六种新的抗体混合液。
4. 然后，将这些抗体混合液分别转移至对应编号的FACS管中。
5. 将细胞悬液与抗体混合物在冰上避光孵育20分钟。
6. 向每支管中加入1mL HBSS 2% FCS，然后在10°C条件下再次以370 × g 离心3分钟。
7. 弃去上清液，并将沉淀重悬于200µL HBSS 2% FCS中。
8. 将重悬后的沉淀转移至新的FACS管中。

表 1：抗体混合液组成。 为实验配制了六种含 200µL HBSS + 抗体的混合液。混合液 1 用于 PMT 设定，混合液 2 至 5 用于补偿设定，混合液 6 用于细胞分选。

5. FACS 校准

1. 首先，打开分选仪并执行“流路启动”。
2. 开启液流，然后等待 15 分钟，使液流稳定。
3. 调节液流振幅以获得分离的液滴形成。然后点击“最佳点”以完成振幅调节。
4. 安装中性密度（N.D.）滤光片 - 1.0，并打开“CST”界面，即流式细胞仪设置与追踪界面。
5. 为执行每日质量控制，首先按照制造商说明用 FACS 培养基稀释 CST 微球，然后进行 CST 控制。
6. CST 控制完成后，将细胞仪上的 N.D. 1.0 滤光片更换为 N.D. 2.0 滤光片。
7. 接下来，按照制造商说明用 FACS 培养基稀释液滴延迟微球，然后将其加载至 FACS 中。
8. 为确保正确分选，请执行 液滴延迟：
   1. 首先点击“电压”，然后点击“光学滤光片”。右象限应等于 100%。如有必要，调节细胞仪上的红色激光螺丝向左或向右，使右象限达到 100%。
   2. 接下来，执行一次测试分选，以确保液流落入收集管中。操作时，点击“废液抽屉”并启动“测试分选”。检查侧向液流是否落入收集管中。若未落入，请调节电压直至其正确落入。
   3. 导航至实验模板，然后打开“Accudrop 液滴延迟”实验，并点击“分选布局”。
   4. 调节流速，使每秒获得 1000 至 3000 个事件。
   5. 点击“电压”，然后点击“光学滤光片”。左象限应为 0，右象限应为 100。
   6. 在“分选布局”窗口中，点击“分选”，然后点击“取消”。此时左象限应为 100，右象限应为 0。如果左象限低于 95，请点击“自动延迟”以自动调节。

6. 流式细胞术与纯度控制

1. 开始流式细胞术时，首先使用试管1（未染色细胞）定义细胞形态以及荧光染料的阴性峰。设置前向散射和侧向散射，并确定每个荧光参数的电压。利用每个散点图上的网格，将阴性细胞群置于第一个对数级范围内。
2. 接着，将试管2（单色对照）上机。调整光谱重叠，直至阴性和阳性群体的中位值对齐，或使用自动计算软件完成补偿。保持信号在量程范围内非常重要。补偿对照必须与实验所用的荧光染料及检测器设置相匹配。记录10,000个事件。
3. 对试管3、4和5（其他单色对照）重复上述步骤。
4. 接着，将试管6（多色染色细胞）上机，并通过特定的设门策略定义目标细胞群体。
5. 在“分选布局”窗口中，选择目标细胞群体。在“目标事件”中设定细胞数量阈值，在“精确度”中选择精确等级。此处仅分选一个群体，但最多可同时分选四个不同群体。
6. 准备就绪后，点击“分选”和“确定”，然后等待细胞分选完成。
7. 细胞分选完成后，进行纯度检测：首先将10µL分选后的细胞转移至一个新的FACS管中，加入90微升含2% FCS的HBSS缓冲液。
8. 然后将该管上机检测，记录并分析细胞表型，以确认设门策略按预期发挥作用。

7. 数据分析

1. 打开“FlowJo”软件，将各管文件拖入“所有样本”窗口中。
2. 双击某个文件，使其在新窗口中打开。
3. 点击“多边形门”工具，重建先前使用的设门策略。
4. 对所有其他文件重复上述步骤。
5. 要查看点图，请点击“布局编辑器”，并将第6管和纯度对照管中的目标细胞群拖入布局编辑器选项卡中。在纯度对照中，仅目标细胞群应显示细胞信号（见图2）。
6. 为检测分选后B淋巴细胞的纯度，点击“表格编辑器”，将第6管和纯度对照中的B淋巴细胞群拖入表格中。
7. 在“统计”菜单中选择CD45⁺细胞的频率以评估该细胞群的纯度，然后点击“创建表格”。
8. 参数值将显示在新生成的表格中。在纯度对照窗口中，检查B淋巴细胞在CD45⁺细胞中的频率，该值应高于98%（见图2，底层面板）。