What is magnetic-activated cell sorting and how does it separate cells?

Magnetic-activated cell sorting, or MACS, is a technique that separates cells based on specific epitopes expressed on their surfaces. Antibodies conjugated to biotin bind target cells, then streptavidin-coupled magnetic beads attach to the biotin. Labeled cells stick to a magnet in a column while unlabeled cells pass through, achieving 60 to 98% retrieval of target cells.

How does the biotin-streptavidin interaction work in MACS?

Biotin, attached to antibodies targeting specific cell surface markers, has high affinity for streptavidin molecules fused to magnetic beads. When biotin and streptavidin come into contact, they bind tightly, coating target cells with magnetic beads. This sandwich complex of cell surface marker, antibody, and magnetic bead enables magnetic capture and separation.

What steps are involved in preparing thymic tissue for MACS isolation?

The thymus is extracted and mechanically dissociated into single cells using a cell strainer and plunger. Unwanted erythrocytes are lysed using ACK buffer. Cells are then centrifuged and resuspended in HBSS with fetal calf serum. Cell concentration is adjusted to 10 to the seventh cells per milliliter before magnetic labeling with anti-CD3 antibodies.

How are CD3-positive T cells labeled and captured during MACS?

Cells are incubated with biotin-coupled anti-CD3 antibodies on ice for 20 minutes, then washed. Streptavidin-coupled magnetic beads are added and incubated for 20 minutes. The labeled cell suspension is pipetted into a column positioned on a magnet, where CD3-positive cells adhere while unlabeled cells flow through into a collection tube.

What is the purpose of using a column in the MACS separation process?

The column contains a non-magnetic matrix that lengthens the path cells travel through the system. This slows cell flow, allowing more time for magnetic beads to capture target cells efficiently. The column improves separation efficiency and increases the percentage of recovered cells compared to direct magnetic separation without a column.

How is the enrichment efficiency of CD3-positive T cells verified after MACS?

Enriched and non-enriched cell samples are stained with fluorescent anti-CD3 antibodies and analyzed using flow cytometry. Dot plots display CD3-positive lymphocytes, which should appear predominantly in the enriched sample. The frequency of CD3-positive cells among all lymphocytes is calculated, with enriched T-cells typically showing 80% or above CD3-positive cells.

What are the differences between positive and negative magnetic sorting?

In positive sorting, cells of interest are captured using magnetic beads coupled to antibodies targeting desired surface markers. In negative sorting, unwanted cells are removed by capturing them with magnetic beads carrying appropriate antibodies. Both approaches use the same MACS principle but differ in which cell population is retained versus discarded.

磁性活细胞分拣（MACS）: 胸腺 T 淋巴细胞的分离

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1. 准备

开始之前，戴上实验室手套和适当的防护服。
清洗所有解剖工具，首先用洗涤剂，然后用70%乙醇，然后用干净的纸巾擦干。
准备 200 mL 的汉克平衡盐溶液（HBSS），含有 2% 的胎儿小牛血清（FCS）。

2. 解剖

将安乐死小鼠固定在解剖板上。
使用剪刀和钳子进行纵向腹腔切除术进入胸腔。
取出心脏，进入位于心脏上方的胸腺。然后，识别胸腺，由两个白色叶组成，位于心脏上方的胸腔。
使用钳子小心地分离胸腺，并将其放在培养皿与 5 mL 的 HBSS 2% FCS。

3. 免疫细胞分离

将胸腺放在40μm细胞滤网上，放在同一个培养皿上。用柱塞粉碎胸腺，使其在同一菜中分离。
分离胸腺和液体转移到15 mL离心管中。
用 5 mL 的 HBSS 2% FCS 清洗培养皿，并将洗涤介质也转移到同一离心管中。
在 20°C 下将管在 370 x g下离心 7 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
将颗粒重新悬浮在2 mL的醋酸钾中，以赖解红细胞。等待 2 分钟，然后用 HBSS 2% FCS 将音量补至 14 mL。
在 20°C 下，在 370 x g下再次将管离心 7 分钟。丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在 5 mL 的 HBSS 2% FCS 中。
使用锥蓝色染色测定估计细胞浓度，并使用适当的HBSS 2%FCS调整最终细胞浓度至10⁷细胞/mL。

4. 免疫细胞的磁性标记

取两个 FACS 管。将一个管标为"非富集T细胞"，另一管"富集T细胞"，使用磁性标记分离。
将细胞溶液分配到两个FACS管中。
在 370 x g下将"富集 T 细胞"管在 20°C 下离心 3 分钟，并丢弃上清液，避免颗粒。
在250 μL的抗CD3生物异位抗体混合物中重新悬浮颗粒（表1，混合1）。

混合	标记试剂	稀释
1	抗CD3生物仿当抗体	1/400 （在哈佛商学院 2% FCS）
2	链球菌结合珠	1/5 （在哈佛商学院 2% FCS）
3	防 CD3 BV421	1/200 （在哈佛商学院 2% FCS）

表1:抗体混合组合。混合1和2用于磁分离。混合3用于评估磁分离后的细胞富集。

在黑暗中4°C下孵育细胞悬浮抗体混合物15分钟。
在20°C下，在370 x g下再次向管中加入3 mL的HBSS 2%FCS，然后再次离心。
丢弃上清液，在 250 μL 链球蛋白耦合珠中重新悬浮颗粒（表 1，混合 2）。
在冰上孵育细胞混合物和珠子20分钟。
接下来，加入 3 mL 的 HBSS 2% FCS，在 370 x g 下再次混合，在 20°C 下再离心 3 分钟。
在 2 mL 的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。

5. CD3-正细胞的磁性分离

将柱放在磁铁上，加入 3 mL 的 HBSS 2% FCS，使系统加湿。等待 5 分钟。
接下来，将标记的单元格移入列中。
细胞悬浮液通过柱后，用3 mL的HBSS 2%FCS清洗柱X3。
然后，从磁铁上取下柱子，并将其放入 15 mL 收集管中。
要洗至目标细胞，将 5 mL 的 HBSS 2% FCS 添加到柱中，然后用柱塞冲洗柱塞。
重复洗脱步骤与另外 5 mL 的 HBSS 2% FCS。

6. 流量细胞测定对靶细胞富集的评价

将500μL的洗脱细胞悬浮液转移到标有"富集T细胞"的FACS管中。将200μL的"非富集T细胞"悬浮液转移到第二个FACS。
然后，在20°C下以370 x g将两个管离心7分钟。
丢弃上清液，然后向两管中加入100 μL荧光抗体混合3（见表1）。
在黑暗中4°C下孵育两个管子20分钟。
接下来，在管中加入 3 mL 的 HBSS 2% FCS，并在 370 x g下在 20°C 下将其离心 3 分钟。
丢弃上清液，然后将每根管重新悬浮在 250 μL 的 HBSS 2% FCS 中。
现在，通过流动细胞测定法评估CD3阳性细胞富集率。

7. 数据分析

打开"FlowJo"图标，在"所有样本"窗口中拖动每个管的文件。
双击"富集 T 单元格"文件，显示 Y 轴上向前散点（FSC-A）和 Y 轴上的侧散射（SSC-A）显示的点图。
点击"多边形"圈出淋巴细胞群。
接下来，双击圆圈填充以创建新窗口。
在 Y 轴上选择"FSC-W"，在 X 轴上选择"FSC-A"，然后圈出 FSA-W 负数。在"子人口标识"窗口中，将单元格群命名为"单个单元格"。
双击圆圈填充以创建新窗口。在 Y 轴上选择"CD3"，然后圈出 CD3 阳性细胞。在"亚人口标识"窗口中命名您的单元格群"T 单元格"。
重复"非富集T细胞"。
要可视化单元格群，请单击"布局编辑器"，并将"T单元格"填充从"富集 T 单元格"和"非富集 T 单元格"文件拖到选项卡中。
将显示表示 CD3+ 淋巴细胞的点图。CD3+ 细胞应只出现在 CD3+ 浓缩管的感兴趣人群中。
要评估已排序单元格中 CD3+ 淋巴细胞的富集性，请单击"表编辑器"，然后将"富集 T 细胞"和"非富集 T 细胞"文件的"T 细胞"总体拖到表中。
在"统计"菜单上，选择"淋巴细胞的频率"细胞以检查所有淋巴细胞中CD3+细胞的百分比，然后单击"创建表"。
参数值将显示在新表中。对于"富集T细胞"，CD3+细胞的频率应在80%左右。

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

资料来源: 穆尼尔·西尔万^1，2，3，佩尔切特·蒂鲍特^1，2，3，苏菲·诺沃^4，雷切尔·戈卢布^1，2，3
¹法国巴黎巴斯德研究所免疫学系淋巴病系
² INSERM U1223，巴黎，法国
³巴黎迪德罗大学，索邦巴黎城，大提琴巴斯德，巴黎，法国
⁴流式细胞测定，细胞学和生物标志物 UtechS，转化科学中…