磁性激活细胞分选（MACS）：胸腺T淋巴细胞的分离

1. 准备

1. 开始之前，戴上实验室手套并穿上适当的防护服。
2. 用洗涤剂清洗所有解剖工具，然后用70%乙醇冲洗，最后用干净的纸巾擦干。
3. 准备含有2%胎牛血清（FCS）的200 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）。

2. 解剖

1. 将已安乐死的小鼠仰卧位固定在解剖板上。
2. 使用剪刀和镊子进行纵向腹腔切口，以进入胸腔。
3. 移除心脏以暴露位于其上方的胸腺。随后辨认胸腺，胸腺由两个白色叶组成，位于胸腔内心脏上方。
4. 用镊子小心分离胸腺，并将其置于含有5 mL HBSS 2% FCS的培养皿中。

3. 免疫细胞分离

1. 将胸腺置于同一培养皿上的 40 µm 细胞滤筛中，用研磨杵在同一个培养皿中研磨胸腺以使其解离。
2. 将解离后的胸腺组织及液体转移至 15 mL 离心管中。
3. 用 5 mL HBSS 2% FCS 洗涤培养皿，并将洗涤液一并转移至同一离心管中。
4. 在 20°C 下以 370 × g 离心 7 分钟，弃去上清液，避免扰动沉淀。
5. 用 2 mL 醋酸钾重悬沉淀以裂解红细胞。静置 2 分钟后，用 HBSS 2% FCS 定容至 14 mL。
6. 再次在 20°C 下以 370 × g 离心 7 分钟，弃去上清液，并用 5 mL HBSS 2% FCS 重悬沉淀。
7. 使用台盼蓝染色法测定细胞浓度，并用适量体积的 HBSS 2% FCS 将最终细胞浓度调整至 10⁷ 个细胞/mL。

4. 免疫细胞的磁性标记

1. 取两个 FACS 管。将其中一个管标记为"非富集 T 细胞"，另一个管标记为"富集 T 细胞"，后者将通过磁标记进行分离。
2. 将细胞悬液均分至这两个 FACS 管中。
3. 将"富集 T 细胞"管在 20°C 下以 370 × g 离心 3 分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
4. 用 250 µL 抗 CD3 生物素化抗体混合液（表 1，混合液 1）重悬沉淀。

混合	标记试剂	稀释比例
1	生物素化抗-CD3 抗体	1/400（溶于含 2% FCS 的 HBSS）
2	链霉亲和素偶联磁珠	1/5（溶于含 2% FCS 的 HBSS）
3	抗-CD3 BV421	1/200（溶于含 2% FCS 的 HBSS）

表1：抗体混合物组成。 混合物1和2用于磁性分离。混合物3用于评估磁性分离后的细胞富集效果。

5. 在4°C避光孵育细胞悬液-抗体混合物15分钟。
6. 向两支试管中各加入 3 mL HBSS 2% FCS，再次于 370 x g 离心 g 在20°C下持续3分钟。
7. 弃去上清液，将沉淀重悬于250 µL链霉亲和素偶联磁珠（表1，混合液2）中。
8. 将细胞混合物与磁珠在冰上孵育20分钟。
9. 接下来，加入3 mL HBSS 2% FCS，充分混匀，然后在20°C下以370 × g离心3分钟。
10. 将沉淀重悬于2 mL HBSS 2% FCS中。

5. CD3阳性细胞的磁分离

1. 将柱子置于磁铁上，加入 3 mL HBSS 2% FCS 以润湿系统。静置 5 分钟。
2. 随后，用移液器将标记的细胞加入柱子中。
3. 待细胞悬液完全通过柱子后，用 3 mL HBSS 2% FCS 洗涤柱子 3 次。
4. 然后，将柱子从磁铁上取下，放入一个 15 mL 收集管中。
5. 为洗脱目标细胞，向柱子中加入 5 mL HBSS 2% FCS，并用推杆冲洗柱子。
6. 再用另外 5 mL HBSS 2% FCS 重复一次洗脱步骤。

6. 通过流式细胞术评估靶细胞富集效果

1. 将500 µL洗脱的细胞悬液转移至标记为"enriched T cells"的FACS管中。将200 µL"non-enriched T cells"悬液转移至第二根FACS管中。
2. 随后，将两根FACS管在20°C下以370 × g离心7分钟。
3. 弃去上清液，然后向两根FACS管中各加入100 µL荧光抗体混合液3（见表1）。
4. 将两根FACS管在4°C避光条件下孵育20分钟。
5. 接着，向FACS管中各加入3 mL含2% FCS的HBSS，并在20°C下以370 × g离心3分钟。
6. 弃去上清液，然后将每根FACS管中的沉淀重悬于250 µL含2% FCS的HBSS中。
7. 现在，通过流式细胞术检测CD3阳性细胞的富集率。

7. 数据分析

1. 打开“FlowJo”图标，将每个管的文件拖入"所有样本"窗口中。
2. 双击"富集的T细胞"文件，显示点图，其中X轴为前向散射（FSC-A），Y轴为侧向散射（SSC-A）。
3. 点击"多边形"工具，圈出淋巴细胞群体。
4. 接着，双击已圈选的群体以创建新窗口。
5. 在Y轴选择"FSC-W"，在X轴选择"FSC-A"，圈出FSC-W阴性细胞。在"亚群识别"窗口中，将该细胞群命名为"单细胞"。
6. 双击已圈选的群体以创建新窗口。在Y轴选择"CD3"，圈出CD3阳性细胞。在"亚群识别"窗口中，将该细胞群命名为"T细胞"。
7. 对"未富集的T细胞"重复上述操作。
8. 为可视化细胞群体，点击"布局编辑器"，并将来自"T细胞"群体的"富集的T细胞"和"未富集的T细胞"文件拖入标签页中。
9. 将显示代表CD3+淋巴细胞的点图。CD3+细胞应仅出现在CD3+富集管的目标细胞群体中。
10. 为评估分选细胞中CD3+淋巴细胞的富集程度，点击"表格编辑器"，然后将来自"T细胞"群体的"富集的T细胞"和"未富集的T细胞"文件拖入表格中。
11. 在"统计"菜单中，选择"淋巴细胞频率"以查看CD3+细胞在所有淋巴细胞中的百分比，然后点击"创建表格"。
12. 参数值将显示在一个新表格中。对于"富集的T细胞"，CD3+细胞的频率应约为80%。