ELISA 检测：间接法、夹心法与竞争法

1. 间接ELISA

间接ELISA是指利用标记的二抗来识别特异性结合抗原的一抗。以下方案示例为一种间接ELISA方法，用于检测甲型流感病毒（IAV）感染小鼠血清样本中是否存在IAV特异性的IgG抗体。该示例的一个优势在于，可使用识别所有抗体同种型或特定同种型（如IgG）的不同二抗。

将抗原包被到微孔板上

1. 使用移液器将50 µL纯化的抗原（2 mg/mL的纯化A/PR/8甲型流感病毒溶于0.05M Tris-HCl缓冲液（pH 9.5）中）加入96孔ELISA板的每个孔中，使孔壁包被抗原。
2. 用自粘性封板膜覆盖板孔，并在4°C下孵育过夜，使抗原与板壁结合。
3. 孵育结束后，将板倒置在水槽上方轻弹，去除包被液。

封闭

4. 通过向包被的孔中每孔加入 200 µL 封闭缓冲液（此处使用含 5% 驴血清的 1× PBS）来封闭剩余的蛋白质结合位点。其他可选封闭试剂包括 PBS 中含 5% 脱脂奶粉或 BSA，或使用产生二抗的动物的正常血清。
5. 在室温下孵育至少 2 小时，或在 4°C 下过夜孵育。
6. 孵育结束后，通过轻弹板子去除封闭缓冲液，然后用含 1% Tween-20 的 PBS 洗涤酶标板。

与一抗孵育

7. 使用1×PBS对含有初级抗体的血清样本进行系列稀释，以获得1至204,800的稀释范围。具体操作为：先将血清稀释1:12.5，然后进行4倍系列稀释（稀释范围为1:12.5至1:204,800）。
8. 向各孔中加入100 µL系列稀释后的血清样本。
9. 用自粘性封板膜覆盖板孔，在室温下孵育1–2小时。
10. 孵育结束后，在水槽上方轻弹微孔板以去除孔内液体，并用含1% Tween-20的PBS洗涤微孔板。

与二抗孵育

11. 向每个孔中加入 100 µL 酶标二抗，本实验中使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的驴抗小鼠二抗。
12. 将酶标板在室温下孵育 1 小时。
13. 孵育结束后，在水槽上方轻拍酶标板以去除孔内液体，随后用含 1% Tween-20 的 PBS 洗涤酶标板。

检测

14. 向每个孔中加入100 µL浓度为1 mg/mL的显色底物（3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB））。
15. 将酶标板在室温下与底物孵育5–10分钟。
16. 孵育10分钟后，加入100 µL 2N 硫酸（H₂SO₄）终止酶促反应。
    加入终止液后30分钟内，使用酶标仪在405 nm波长下读取酶标板，测定各孔的吸光度。

2. 夹心 ELISA

在此ELISA版本中，实验样本是 "夹层式" 在未标记的捕获抗体和标记的检测抗体之间进行反应，两种抗体均特异性结合同一蛋白质的不同表位。在以下夹心 ELISA 示例中，利用已知浓度的标准品——重组人 TNFα（起始浓度为 75 pg/mL）进行 2.5 倍系列稀释，绘制标准曲线，据此测定未知样品中人 TNFα 的浓度。

将捕获抗体包被到微孔板上

1. 通过向每孔中加入100 µL捕获抗体（浓度范围为1–10 µg/mL），将纯化的捕获抗体包被至96孔ELISA板的孔中。
2. 用粘性板盖覆盖板子，并在4°C下孵育过夜。
3. 孵育结束后，将板子在水槽上方轻甩，去除包被液。

封闭

4. 通过向已包被抗体的孔中加入 200 µL 封闭液（含 5% 脱脂奶粉的 PBS）来封闭剩余的蛋白质结合位点。
5. 在室温下孵育至少 2 小时，或在 4°C 下过夜孵育。
6. 孵育结束后，轻弹微孔板以去除封闭液，随后用含 1% Tween-20 的 PBS 洗涤微孔板。

加入含抗原的待测样本

7. 向孔中加入 100 µL 测试样品。用粘性封板膜密封酶标板。
8. 在室温下孵育 1–2 小时，或在 4°C 下过夜孵育。
9. 孵育结束后，将酶标板在水槽上方轻甩以弃去样品，然后用含 1% Tween-20 的 200 µL 1X PBS 洗涤各孔。

加入酶偶联的检测抗体

10. 向各孔中加入100 µL酶标检测抗体，浓度为预先优化好的浓度。
11. 用自粘性封板膜密封酶标板，在室温下孵育2小时。
12. 将酶标板在水槽上方轻弹以去除未结合的检测抗体，并用200 µL含1% Tween-20的1X PBS洗涤各孔。

检测

13. 加入100 µL浓度为1 mg/mL的显色底物。任何结合的酶标记检测抗体都将底物转化为可检测的信号。
14. 在室温下孵育5–10分钟。
15. 5–10分钟后，向各孔中加入100 µL 2N H₂SO₄以终止酶促反应。在加入终止液后的30分钟内，使用酶标仪读取平板，测定各孔的吸光度。

3. 竞争性ELISA

竞争性ELISA的步骤与间接ELISA和夹心ELISA不同，主要区别在于样本抗原与"添加"抗原之间的竞争性结合步骤。将样本抗原与未标记的一抗共同孵育，然后将这些抗体-抗原复合物加入已包被相同抗原的ELISA板中。经过一段时间的孵育后，洗去未结合的抗体。可结合微孔中抗原的游离抗体的量与原始样本中抗原的量呈负相关。例如，抗原含量丰富的样本会形成更多的抗原-一抗复合物，导致能够结合到ELISA板上的游离抗体减少。随后向各孔中加入针对一抗的酶标记二抗，再加入底物。

将抗原包被到微孔板上

1. 用浓度为 1–10 μg/mL 的纯化抗原溶液，每孔加入 100 μL，包被 96 孔 ELISA 板的孔壁。
2. 用粘性封板膜覆盖板孔，于 4°C 下孵育过夜。
3. 孵育结束后，将板子在水槽上方轻甩，去除未结合的抗原溶液。

封闭

4. 通过向每个包被的孔中加入 200 μL 封闭缓冲液（可为含 5% 脱脂奶粉或 BSA 的 PBS）来封闭剩余的蛋白质结合位点。
5. 在室温下孵育平板至少 2 小时，或在 4°C 下过夜孵育。

将孵育样本（抗原）与一抗孵育

6. 封闭孔板的同时，为每孔检测配制抗原-抗体混合液，将150 μL样品抗原与150 μL一抗混合。
7. 将该混合液于37°C孵育1小时。

将抗原-抗体混合物加入孔中

8. 现在，将板子在水槽上方轻弹，弃去封闭缓冲液。
9. 然后，用含吐温-20的1×PBS洗涤各孔。
10. 每孔加入100 μL样品抗原与一抗的混合液。
11. 37°C孵育1小时。
12. 将板子在水槽上方轻弹，弃去样品混合液。
13. 然后，用含1%吐温-20的1×PBS洗涤各孔，以去除未结合的抗体。

加入二抗

14. 向每个孔中加入 100 μL 酶标二抗，本实验中为碱性磷酸酶（AP）标记的抗体。
15. 将酶标板在 37°C 下孵育 1 小时。
16. 孵育结束后，用含 1% Tween-20 的 1× PBS 洗涤酶标板。

检测

17. 向每个孔中加入 100 μL 底物溶液。
18. 等待 5–10 分钟。
19. 10 分钟后，向孔中加入 100 μL 2N 硫酸以终止酶促反应。随后，在加入终止液后的 30 分钟内，使用酶标仪测定吸光度。