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资料来源:迈克尔·李1和托尼娅·韦伯1
1马里兰大学医学院微生物学和免疫学系，马里兰州巴尔的摩的马琳和斯图尔特·格林鲍姆综合癌症中心 21201
免疫组织化学 （IHC） 和免疫细胞化学 （ICC） 是使用抗体可视化特定抗原的表达和定位的技术。IHC的首次使用是在1941年，当时阿尔伯特·库因斯利用这项技术来可视化感染肺炎球菌（1）的小鼠在组织部分中存在肺炎球菌抗原。名称，免疫组织化学，是从根"免疫-"，指抗体，和"组织-"，参照IHC中使用的组织部分。免疫细胞化学中根的"细胞-"突出了ICC和IHC之间的关键区别。IHC使用整个组织的各个部分，而ICC使用从组织分离或培养的细胞。所用样品的差异意味着样品制备在技术上因IHC和ICC而异，但除此之外，ICC和IHC的协议是相同的，人们会发现这些术语是可互换使用的。
在IHC和ICC中，分别带有化学或荧光标记的抗体，如过氧化物酶或罗丹，通过标记的抗体与抗原的特异性结合，用于可视化任何感兴趣的抗原的分布。在IHC的情况下，薄薄的组织切片被固定在幻灯片上，在被染色之前保持组织的结构，从而允许在整个组织环境中显示抗原（图1）。在ICC的情况下，细胞在被染色之前均匀地分布在幻灯片上，允许在单个细胞内显示抗原分布，但不在任何特定组织的结构内。由于两个协议之间的相似性，该协议将侧重于IHC，以解决IHC中涉及样品制备的额外复杂性。
图1:IHC协议大纲。从小鼠解剖的石蜡嵌入组织的 IHC 协议的视觉轮廓。该协议使用生物回位抗体和链球菌-HRP来可视化抗体结合的位置。其他选项，如荧光标记抗体，也是可能的。请点击此处查看此图的较大版本。
执行 IHC 时的第一个重大决策是如何准备组织部分，以便在整个染色过程中保持组织的结构。两个主要选择是石蜡嵌入组织或冷冻组织的新鲜部分的正式固定部分。对于使用哪种方法，没有简单的答案，因为它取决于将进行的下游分析。石蜡嵌入组织的形式固定通常被认为可以更好地保存组织形态，以实现最佳成像，而冷冻新鲜组织可以保留蛋白质功能，用于 IHC 以外的后续检测。此外，新鲜冷冻组织部分已被证明更适合基因表达分析（2）。第三个考虑因素是，您感兴趣的抗原的抗体是否适合固定或冷冻组织部分，因为某些抗体仅针对特定类型的部分进行了优化，可能不适用于其他部分。最后，还需要确定它们需要多久来储存组织部分，因为新鲜冷冻样品必须保持在-80°C，并且不能持续超过一年，而固定切片可以在室温下储存更长时间。这些是确定是使用石蜡嵌入组织的形式固定部分还是冷冻组织的新鲜部分的一些主要考虑因素。最终，如果一个人有足够的组织，最好只是有一些两者。
在这个实验中，我们开始确定环素D1表达是否从淋巴瘤发育的自发小鼠模型增大了扩大的脾脏。首先从野生型小鼠、没有淋巴瘤的转基因小鼠或自发发展淋巴瘤的转基因小鼠中分离出脾组织样本。脾脏组织样本固定在甲醛中，嵌入石蜡中，分片，使用小鼠抗环素D1原抗体染色，然后使用马抗小鼠二次抗体，并使用3，3-二氨基苯甲酸（DAB）开发。然后，在哈里斯赫马图林溶液中对节进行反染色，然后以20倍放大倍率对各部分进行成像。
试剂
石蜡嵌入部分
新鲜冷冻部分
染色
1. 免疫细胞化学细胞的制备
2. 为染色准备形式固定、石蜡嵌入部分
脱蜡化
补液
阻断内源性过氧化物酶活性
抗原检索
3. 制备用于染色的新鲜冷冻、OTC 内嵌部分
4. 染色
阻塞
初级抗体孵育
二次抗体孵育
色彩开发
反染色（如果需要）
脱水
安装和盖玻片应用
微观分析
免疫细胞化学和免疫组织化学是培养细胞和组织中感兴趣的蛋白质的染色方法。两种相关技术的基本原理是使用与检测系统标记的特定抗体来识别和可视化蛋白质，并确定其在细胞和组织内的位置以及相对水平。两个实验中的过程都从样品制备开始。
免疫细胞化学，专门可视化细胞中的蛋白质或抗原位置，这涉及三个步骤。第一步是电镀，这需要培养生长介质中的细胞在盖滑或滑动，通常，在培养板的井。其次是固定，在细胞中加入一种沉淀或交联剂（如甲醛），以保持蛋白质的结构完整性，防止酶活性降解。最后一步是渗透，这涉及添加洗涤剂，使细胞膜渗透的染色。
在对应方法中，免疫组织化学、蛋白质或抗原在组织中可视化，样品制备有五个步骤。首先，整个组织被固定，通常与甲醛。然后，将组织嵌入石蜡块中，然后用一种称为微体机的机器分割这个块，将组织切成薄片，可以放置在幻灯片上。接下来，对幻灯片进行脱蜡，或从组织切片周围去除石蜡。然后，可以执行可选的抗原检索步骤。这既可以用热或酶来揭开在固定过程中交联的表位，使它们可用于抗体结合。适当的样品制备后，将目标特异性原抗体添加到细胞或组织样本中。这种初级抗体应与感兴趣的蛋白质结合。接下来，添加二级抗体，检测并结合原抗体。这种二次抗体与一种称为HRP的酶结合，或可以结合。当添加其特定的基板 DAB 时，HRP 将其转换为不溶性棕色沉淀物。这个棕色的污渍标志着目标蛋白的位置。幻灯片还沾染了血氧素，将原子核标为蓝色，并为确定亚细胞定位提供空间参考点。之后，安装介质将添加到幻灯片中，然后加盖滑移，以密封和保存染色样品。最后，可以在光学显微镜上成像幻灯片。
在本视频中，您将观察镀层细胞和组织部分的样品制备技术，然后对组织部分进行免疫染色。
首先，感兴趣的细胞需要坐在盖玻片上。为此，在组织培养罩中工作，将单个盖玻片放入 24 孔板的井中。然后，关闭窗框并打开紫外线，对盖玻片进行至少 15 分钟的消毒。接下来，关闭紫外线。要将感兴趣的细胞从10厘米的培养皿中抬起，吸气介质，用PBS短暂清洗，并将胰蛋白酶加入细胞2分钟。然后，点击板的一侧，确保细胞已分离，并用介质中和胰蛋白酶。接下来，添加 0。5 mL 的电池悬浮液进入每个孔中，确保盖住盖玻片。将板放入加湿的 CO2 培养箱中，让细胞在 37 摄氏度下生长，直到它们汇合 50-70%。
一旦细胞达到最佳汇合，从每个孔中吸出培养基，然后通过在中孵育细胞来固定细胞。在室温下，在1X PBS中稀释5mL4%的甲醛20分钟。去除固定剂后，冲洗细胞在每个盖玻片上添加1mL的1X PBS。立即吸出 PBS，然后重复冲洗 2 次，共洗 3 次。
现在，通过在 1X PBS 中向每个井中添加 0.5 mL 的 0.1% Triton X-100 来渗透细胞。将盘子在室温下保持15分钟。吸气缓冲液，然后通过在每个井中加入1mL的1X PBS来冲洗细胞。立即吸出 PBS 并重复冲洗 2 次，共洗 3 次。现在，盖玻上的细胞是固定和渗透的，继续为以下免疫组织化学示例演示的染色程序，但孵育应在 24 孔板的孔内进行而不是直接在组织部分幻灯片上。
首先，获得准备好的、正式固定的石蜡嵌入组织部分。将幻灯片放入滑架中，然后完全浸入 250 mL 的 100% 二甲苯中，从而对幻灯片进行脱脂。让幻灯片在二甲苯中孵育5分钟。然后，从容器中取出幻灯片，用纸巾擦去，然后放入新的二甲苯浴中，再放入一个新鲜的容器中 5 分钟。
接下来，从100%乙醇开始，在一系列分级乙醇溶液中重新水化各部分3分钟。用纸巾擦拭滑架，并将幻灯片转移到 100% 乙醇的新容器中再工作 3 分钟。继续这个循环的洗涤，用纸巾干燥，并在指定时间内按照指示的乙醇浓度将滑梯转移到新的浴缸中。最后一次乙醇清洗后，用纸巾擦去机架，在室温下用100 mL的0.3%过氧化氢孵育幻灯片30分钟，以阻止任何内源性过氧化物酶活性。在 250 mL 的 1X PBS 中清洗幻灯片 5 分钟。在新鲜 1X PBS 的容器中重复洗涤 5 分钟。
接下来，通过将 IHC 青基酸盐缓冲液中的 250 mL 中滑片浸入 pH 6.0 中，然后煮沸 20 分钟，执行抗原回收。然后，继续染色协议。
要开始 IHC 的染色过程，请用疏水笔圈出各部分，以确定缓冲液需要覆盖的最小面积。然后，使用移液器放置100微升的阻塞缓冲液，这在这个实验中是马血清稀释在1XPBS，在部分。在室温下孵育幻灯片1小时。之后，使用移液器移除阻塞缓冲区。
接下来，通过在1X PBS中稀释的990微升马血清，在1:100稀释时稀释原抗体并阻断缓冲液。5 mL Eppendorf管，然后是10微升的原发抗体。在每个部分加入100微升稀释的原抗体，并在室温下孵育幻灯片30分钟。当计时器响起时，将原抗体从每张幻灯片上排出，然后在 250 mL 的 1X PBS 中洗涤 5 分钟。使用新鲜的 1X PBS 再次重复此洗涤。
当幻灯片在1X PBS中洗涤时，通过在1.5 mL管中加入995微升的阻断缓冲液，然后加入5微升的二级抗体，将二次抗体稀释至1:200稀释，在这种情况下，这是生物酸淡马抗小鼠IGG。在每个部分加入100微升稀释的二级抗体，然后在室温下孵育幻灯片30分钟。30分钟后，将二级抗体从部分中排出，然后在250 mL的1X PBS中清洗幻灯片5分钟。使用新鲜的 1X PBS 重复此洗涤。
现在，加入100微升的阿丁-生物锡复合试剂，在室温下在黑暗中孵育30分钟。接下来，将幻灯片浸入 1X PBS 的 250 mL 中，洗涤 5 分钟。与以前的洗涤步骤类似，使用新鲜的 1X PBS 再次重复此洗涤。接下来，通过在 100 微升 DAB 中孵育各部分长达 5 分钟来开发幻灯片。将部分浸在 250 mL 蒸馏水中 5 分钟，停止开发。
现在，如果需要，可以对幻灯片进行反染色。为此，在 250 mL 的哈里斯赫马图林溶液中短暂浸入幻灯片。将滑片在 250 mL 蒸馏水中洗涤 5 分钟，冲洗掉污渍。使用新鲜的蒸馏水再重复1次洗涤。接下来，使部分脱水。为此，首先用95%乙醇孵育幻灯片5分钟。将幻灯片放在纸巾上，再将它们转移到新鲜 95% 乙醇的新容器中再多 5 分钟。继续循环清洗，用纸巾打上印迹，并将幻灯片转移到新浴缸，按照所示溶液各5分钟。
完成孵育后，用纸巾将幻灯片斑点，然后将一滴安装介质（如有机体-柠檬山）添加到幻灯片中。现在，在各部分放置一个盖玻片，注意不要捕获气泡。现在，这些幻灯片已准备就绪，可在显微镜下进行分析。
要观察染色部分，请使用标准光学显微镜来可视化污渍，使用数码相机来捕捉图像。在这个IHC的这一特殊例子中，比较了来自野生型和自发性、双转基因或DTG小鼠的脾组织，用于研究淋巴瘤中的Dyclin D1表达。组织被石蜡嵌入，切片，并沾染抗环素D1抗体，并成像在20倍放大倍数。Cyclin D1 表达细胞在蓝色组织背景上由红褐色表示。比较不同小鼠图像中的染色强度，无论小鼠基因型如何，未放大的脾脏的Cyclin D1表达量都相对较低。相比之下，DTG小鼠的脾脏增大，显示红褐色染色增加，表明此小鼠模型中的癌症发育与Cyclin D1表达之间存在相关性。
免疫细胞化学和免疫组织化学分别是培养细胞和组织中目标蛋白质的染色方法。两种相关技术的基本原理都涉及使用标有检测系统标记的特异性抗体来识别和可视化蛋白质，并确定其在细胞和组织中的位置以及相对水平。任一实验中的过程都从样品制备开始。
对于免疫细胞化学，专门可视化细胞中的蛋白质或抗原位置，这涉及三个步骤。第一步是铺板，这需要在盖玻片或载玻片上的生长培养基中培养细胞，通常在培养板的孔中。然后是固定，其中向细胞中添加沉淀剂或交联剂（如多聚甲醛）以保持蛋白质的结构完整性并防止酶活性降解它们。最后一步是透化，包括添加去污剂以使细胞膜具有染色的渗透性。
在对应的方法中，免疫组织化学、蛋白质或抗原在组织中可视化，样品制备有五个步骤。首先，对整个组织进行固定，通常使用多聚甲醛。然后将组织包埋在石蜡块中，然后使用称为切片机的机器将该块切片，将组织切成薄片，然后放在载玻片上。接下来，对载玻片进行脱蜡处理，或从组织切片周围去除石蜡。然后，可以执行可选的抗原修复步骤。这可以使用加热或酶来揭示固定过程中交联的表位，使其可用于抗体结合。在适当的样品制备后，将靶标特异性一抗添加到细胞或组织样品中。该一抗应与目标蛋白结合。接下来，添加二抗，该二抗检测并结合一抗。这种二抗与一种称为 HRP 的酶偶联，或可以与一种称为 HRP 的酶结合。当添加其特异性底物 DAB 时，HRP 将其转化为不溶的棕色沉淀物。这种棕色染色标记了靶蛋白的位置。载玻片还用苏木精染色，苏木精用蓝色标记细胞核，并为确定亚细胞定位提供空间参考点。之后，将封固剂添加到载玻片中，然后添加盖玻片，以密封和保存染色的样品。最后，可以在光学显微镜上对载玻片进行成像。
在本视频中，您将观察铺板细胞和组织切片的样品制备技术，然后对组织切片进行免疫染色。
首先，需要将感兴趣的细胞放在盖玻片上。为此，在组织培养罩中工作，将单个盖玻片放入 24 孔板的孔中。然后，关闭窗扇并打开紫外线灯，对盖玻片消毒至少 15 分钟。接下来，关闭紫外线灯。要从汇合的 10 cm 培养皿中取出目标细胞，请吸出培养基，用 PBS 短暂洗涤，并向细胞中加入胰蛋白酶 2 分钟。然后，敲击板的侧面以确保细胞已分离并用培养基中和胰蛋白酶。接下来，添加 0。将 5 mL 细胞悬液放入每个孔中，确保盖玻片上盖上。将板放入加湿的 CO2 培养箱中，让细胞在 37 摄氏度下生长，直到它们达到 50-70% 汇合。
一旦细胞达到最佳汇合度，从每个孔中吸出培养基，然后通过在 中孵育细胞来固定细胞。5 mL 4% 多聚甲醛，在 1X PBS 中在室温下稀释 20 分钟。去除固定剂后，冲洗细胞，在每个盖玻片上加入 1 mL 1X PBS。立即吸出 PBS，然后重复冲洗 2 次，总共洗涤 3 次。
现在，通过向每个孔中加入 0.5 mL 的 0.1% Triton X-100 的 1X PBS 溶液来透化细胞。将板在室温下放置 15 分钟。吸出透化缓冲液，然后向每个孔中加入 1 mL 1X PBS 冲洗细胞。立即吸出 PBS 并重复冲洗 2 次，总共洗涤 3 次。现在，盖玻片上的细胞已固定和透化，请继续进行以下免疫组织化学示例演示的染色程序，但孵育应在 24 孔板的孔内进行，而不是直接在组织切片载玻片上进行。
首先，获得准备好的、福尔马林固定的、石蜡包埋的组织切片。将玻片放入玻片架中，然后将其完全浸入 250 mL 100% 二甲苯中，使其脱蜡。让玻片在二甲苯中孵育 5 分钟。然后，从容器中取出载玻片，用纸巾擦去，然后将它们放入新容器中的新二甲苯浴中再放置 5 分钟。
接下来，在一系列分级乙醇溶液中对切片进行再水化，从 100% 乙醇开始，持续 3 分钟。用纸巾擦去玻片架，然后将玻片转移到装有 100% 乙醇的新容器中再放置 3 分钟。继续洗涤、用纸巾擦干，并在指定时间内按照指定浓度的乙醇将载玻片转移到新浴中。最后一次乙醇洗涤后，用纸巾擦去架子，并将玻片在 100 mL .3% 过氧化氢中在室温下孵育 30 分钟，以阻断任何内源性过氧化物酶活性。在 250 mL 1X PBS 中洗涤玻片 5 分钟。在装有新鲜 1X PBS 的容器中重复此洗涤，再洗涤 5 分钟。
接下来，将玻片浸入 pH 值为 6.0 的 250 mL IHC 柠檬酸盐缓冲液中并煮沸 20 分钟，进行抗原修复。然后，继续执行染色方案。
要开始 IHC 的染色过程，请用疏水笔圈出切片，以确定缓冲液需要覆盖的最小区域。然后，使用移液管将 100 μL 封闭缓冲液（在本实验中是用 1X PBS 稀释的马血清）置于切片上。将玻片在室温下孵育 1 小时。然后，使用移液管去除封闭缓冲液。
接下来，将 990 μL 用 1X PBS 稀释的马血清加入 1 培养基中，以 1：100 的比例稀释一抗和封闭缓冲液。5 mL Eppendorf 管，然后加入 10 μL 一抗。向每个切片中加入 100 μL 稀释的一抗，并在室温下孵育玻片 30 分钟。当计时器响起时，从每张玻片上排空一抗，然后在 250 mL 1X PBS 中洗涤 5 分钟。使用新鲜的 1X PBS 再次重复此洗涤。
当载玻片在 1X PBS 中洗涤时，将 995 μL 封闭缓冲液加入 1.5 mL 试管中，然后加入 5 μL 二抗，在本例中为生物素化的马抗小鼠 IGG，将二抗稀释至 1：200 稀释。向每个切片中加入 100 μL 稀释的二抗，然后在室温下孵育玻片 30 分钟。30 分钟后，将二抗从切片上排干，去除二抗，然后在 250 mL 1X PBS 中洗涤玻片 5 分钟。使用新鲜的 1X PBS 重复此洗涤。
现在，加入 100 μL 亲和素-生物素复合物试剂，并在室温下避光孵育切片 30 分钟。接下来，将玻片浸入 250 mL 1X PBS 中 5 分钟，洗涤玻片。与之前的洗涤步骤类似，使用新鲜的 1X PBS 再重复一次洗涤。接下来，通过将切片在 100 μL DAB 中孵育长达 5 分钟来显影玻片。将切片浸入 250 mL 蒸馏水中 5 分钟，停止显影。
现在，如果需要，可以对玻片进行复染。为此，将载玻片短暂浸入 250 mL 的 Harris 苏木精溶液中。用 250 mL 蒸馏水洗涤玻片 5 分钟，冲洗掉复染剂。使用新鲜蒸馏水再重复此洗涤 1 次。接下来，对各部分进行冻结。为此，首先将玻片在 95% 乙醇中孵育 5 分钟。在纸巾上吸干玻片，然后将它们转移到装有新鲜 95% 乙醇的新容器中再放置 5 分钟。继续洗涤、用纸巾吸干并将玻片转移到新浴中，按照指示的溶液每次 5 分钟。
最后一次孵育后，用纸巾吸干载玻片，然后在载玻片上加入一滴封固剂，例如 Organo-Limonene Mount。现在，将盖玻片盖在切片上，注意不要捕获气泡。玻片现在可以在显微镜下观察以进行分析。
要观察染色切片，请使用标准光学显微镜观察染色，并使用数码相机捕获图像。在这个特定的 IHC 示例中，比较了野生型和自发性、双转基因或 DTG 小鼠的脾组织，以研究淋巴瘤中 Dyclin D1 的表达。对组织进行石蜡包埋、切片和抗细胞周期蛋白 D1 抗体染色，并以 20 倍放大倍率成像。表达细胞周期蛋白 D1 的细胞在蓝色组织背景下以红棕色表示。比较来自不同小鼠的图像之间的染色强度，无论小鼠基因型如何，未增大的脾脏都具有相对较低的细胞周期蛋白 D1 表达量。相比之下，DTG 小鼠增大的脾脏显示红棕色染色增加，表明该小鼠模型中癌症发展与 Cyclin D1 表达之间存在相关性。
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