免疫组织化学与免疫细胞化学：基于光学显微镜的组织成像

1. 免疫细胞化学实验的细胞准备

1. 将0.5 mL细胞悬液加入24孔培养板的孔中，使目标细胞接种于带腔室的载玻片或带腔室的盖玻片上。
   注意：某些细胞可能需要在经处理的盖玻片上生长，例如经多聚赖氨酸处理的盖玻片。最佳处理条件应由使用者根据所用细胞类型自行确定。
2. 将培养板放入加湿的CO₂培养箱中，在37°C条件下培养细胞，直至细胞融合度达到50–70%。
3. 当细胞达到最佳融合度时，吸除各孔中的培养基，然后加入0.5 mL 4%多聚甲醛（用1×PBS稀释），室温孵育20分钟以固定细胞。
4. 移除固定液，并用1 mL 1×PBS洗涤各孔三次。
5. 接着，向每孔加入0.5 mL含0.1% Triton-X-100的1×PBS溶液，室温孵育15分钟，以通透细胞。
6. 吸除通透缓冲液，并用1 mL 1×PBS洗涤各孔三次。
7. 此时盖玻片上的细胞已完成固定与通透处理。可继续进行后续染色操作，如以下免疫组织化学示例所示；但需注意，孵育步骤应在24孔板的孔内进行，而非直接在组织切片载玻片上进行。

2. 染色用福尔马林固定、石蜡包埋切片的制备

1. 获取已制备的福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。

脱蜡

2. 将载玻片浸入100%二甲苯中，每次5分钟，重复两次。

重悬

3. 将载玻片浸入100%乙醇中，每次3分钟，重复两次。
4. 将载玻片浸入95%乙醇中3分钟。
5. 将载玻片浸入70%乙醇中3分钟。
6. 将载玻片浸入50%乙醇中3分钟。

阻断内源性过氧化物酶活性

7. 将切片置于100 mL的0.3% H₂O₂中，室温孵育30分钟。
8. 用1X PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗2次。

抗原修复

9. 将切片浸入IHC柠檬酸盐缓冲液（pH 6）中，煮沸20分钟。
10. 组织切片现已准备好进行染色。

3. 染色用新鲜冷冻OCT包埋切片的制备

1. 将5 mm的新鲜分离组织放入模具中，并加入OCT包埋剂，直至完全覆盖组织。
2. 将组织块缓慢浸入液氮中，直至完全冻结。样品可在-80°C下保存长达1年。
3. 准备切片时，将冷冻的组织块转移至冷冻切片机中，并使整个装置平衡至-20°C。
4. 使用冷冻切片机切割5–10 µm厚的组织切片，并用刷子将切片直接转移至适用于免疫组化（IHC）的玻片上。
5. 室温下干燥玻片过夜。玻片也可在-80°C下保存。
6. 将玻片浸入250 mL的4%多聚甲醛（PFA）中，室温固定15分钟，以在染色前完成固定。最佳固定方法应由使用者根据实验条件确定。
7. 将玻片浸入250 mL的1× PBS中，重复2次，每次5分钟。
8. 将玻片浸入250 mL的0.3% H₂O₂中，室温孵育30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
9. 将玻片浸入250 mL的1× PBS中，重复2次，每次5分钟。
10. 此时，玻片已准备好进行染色。

4. 染色

1. 使用疏水屏障笔在组织周围画圈。

封闭

2. 使用移液器，将 100 µL 封闭缓冲液（马血清用 1X PBS 稀释）加至切片上，室温孵育 1 小时。
3. 用移液器移除封闭缓冲液。

一抗孵育

4. 将圈出的组织与 100 µL 稀释的一抗溶液（小鼠抗人 cyclin D1 抗体，用封闭缓冲液按 1:100 稀释）在室温下孵育 30 分钟。
5. 从每张切片上移除一抗溶液，并用 1× PBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 2 次。

二抗孵育

6. 将样品与100 µL稀释的生物素化二抗（生物素化马抗小鼠IgG，1:200稀释）在室温下孵育30分钟。
7. 通过倾去切片上的液体去除二抗，再用1× PBS洗涤2次，每次5分钟。

显色反应

8. 使用 HRP 进行显色：加入 100 µL 亲和素-生物素复合物（ABC）试剂，将切片在室温下避光孵育 30 分钟
   注意：也可使用荧光标记的抗体，并通过合适的显微镜进行观察。
9. 用 1X PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤 2 次。
10. 加入 100 µL DAB 孵育切片，孵育时间最长不超过 5 分钟，以显色。
11. 加入蒸馏水（dH₂O）在室温下孵育 5 分钟，以终止显色反应。

复染（如需要）

12. 将切片短暂浸入 Harris 苏木精溶液（或 0.5% 甲基绿的 0.1 M 醋酸钠溶液（pH 4.2））中染色 10 分钟。
13. 用去离子水（dH₂O）洗涤切片两次，每次 5 分钟，以去除复染液。

脱水

14. 将载玻片浸入95%乙醇中，每次5分钟，重复两次。
15. 将载玻片浸入100%乙醇中，每次5分钟，重复两次。
16. 将载玻片浸入100%二甲苯中，每次5分钟，重复两次。
17. 用纸巾轻轻吸干载玻片。

封片与盖玻片的放置

18. 向切片上滴加一滴封片剂（如柠檬烯有机封片剂），然后盖上盖玻片。

显微分析

19. 在适当的显微镜下观察染色切片以进行分析。此处使用标准光学显微镜进行观察，并使用配备的数字相机进行成像。