免疫组织化学与免疫细胞化学：基于光学显微镜的组织成像

免疫细胞化学和免疫组织化学分别是用于培养细胞和组织中目标蛋白染色的方法。这两种相关技术的基本原理均是利用带有检测系统的特异性抗体来识别和可视化蛋白，确定其在细胞和组织内的定位以及相对表达水平。这两种实验的流程均始于样品制备。

免疫细胞化学用于特异性地显示蛋白质或抗原在细胞内的定位，该过程包括三个步骤。第一步是铺板，即将细胞在培养皿孔中的盖玻片或载玻片上，用生长培养基进行培养。第二步是固定，即向细胞中加入如多聚甲醛等沉淀性或交联性固定剂，以保持蛋白质的结构完整性，并防止酶活性降解蛋白质。最后一步是透化，即加入去垢剂使细胞膜通透，以便进行染色。

在对应的免疫组织化学方法中，蛋白质或抗原在组织中被可视化，样本制备包含五个步骤。首先，整个组织通常使用多聚甲醛进行固定。随后将组织包埋于石蜡块中，再使用一种称为切片机的仪器将石蜡块切片，获得可转移至载玻片上的薄切片。接下来，载玻片需进行脱蜡处理，即去除组织切片周围的石蜡。然后可选择性地进行抗原修复步骤，该步骤可通过加热或酶处理来实现，以暴露因固定过程中交联而被遮蔽的抗原表位，使其能够与抗体结合。在完成适当的样本预处理后，向细胞或组织样本中加入针对目标蛋白的特异性一抗。该一抗应能与目标蛋白特异性结合。随后加入二抗，其可识别并结合一抗。该二抗偶联或可结合一种名为HRP的酶。当加入其特异性底物DAB后，HRP将DAB转化为不溶性的棕褐色沉淀物。该棕褐色染色即标记了目标蛋白的位置。载玻片还使用苏木精进行复染，使细胞核呈蓝色，为判断蛋白的亚细胞定位提供空间参照。之后，在载玻片上加入封片介质，并加盖盖玻片，以密封和保存染色样本。最后，可在光学显微镜下对载玻片进行成像。

在本视频中，您将观察贴壁细胞和组织切片的样品制备技术，随后进行组织切片的免疫染色。

首先，需要将目标细胞接种到盖玻片上。操作时，在组织培养罩内将单个盖玻片放入24孔板的各孔中。然后关闭罩门，打开紫外灯，对盖玻片灭菌至少15分钟。随后关闭紫外灯。从融合度为100%的10厘米培养皿中收集目标细胞时，吸除培养基，用PBS短暂洗涤，加入胰蛋白酶作用2分钟。接着轻拍培养皿侧面，确保细胞已脱落，并用培养基中和胰蛋白酶。随后，将0.5 mL细胞悬液加入每孔中，确保完全覆盖盖玻片。将培养板放入加湿的CO2培养箱中，于37摄氏度培养，直至细胞融合度达到50–70%。

当细胞达到最佳汇合度时，吸去每个孔中的培养基，然后在室温下用 0.5 mL 用 1× PBS 稀释的 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。去除固定液后，向每个盖玻片上加入 1 mL 1× PBS 清洗细胞。立即吸去 PBS，再重复清洗 2 次，共洗涤 3 次。

现在，通过向每个孔中加入 0.5 mL 含 0.1% Triton X-100 的 1X PBS 来对细胞进行透化处理。将培养板在室温下放置 15 分钟。吸除透化缓冲液，然后通过向每个孔中加入 1 mL 1X PBS 来冲洗细胞。立即吸除 PBS，并重复冲洗 2 次，共完成 3 次洗涤。至此，盖玻片上的细胞已完成固定和透化处理，接下来进行染色操作，其步骤与后续展示的免疫组织化学示例相同，但孵育过程应在 24 孔板的孔内进行，而非直接在组织切片载玻片上进行。

首先，获取已制备好的甲醛固定、石蜡包埋的组织切片。将切片置于载玻片架中，完全浸入250 mL的100%二甲苯中进行脱蜡。在二甲苯中孵育5分钟。随后，将切片从容器中取出，用纸巾轻轻擦拭，并转移至新容器中的新鲜二甲苯浴中，继续孵育5分钟。

接下来，将切片依次浸入梯度乙醇溶液中进行复水，首先用100%乙醇处理3分钟。用纸巾擦干载玻片架，然后将载玻片转移至另一容器中的100%乙醇中继续孵育3分钟。按照指定的乙醇浓度和时间，重复进行洗涤、用纸巾干燥并转移载玻片至新试剂的操作。最后一次乙醇洗涤后，用纸巾擦干载玻片架，将载玻片置于100 mL的0.3%过氧化氢溶液中，室温孵育30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。随后将载玻片在250 mL的1×PBS缓冲液中洗涤5分钟。再换用新鲜的1×PBS缓冲液，在另一容器中重复洗涤5分钟。

接下来，将切片浸入250 mL pH 6.0的IHC柠檬酸缓冲液中，煮沸20分钟以进行抗原修复。然后，继续进行染色实验步骤。

开始进行免疫组化染色时，使用疏水性笔在组织切片周围画圈，以界定缓冲液需要覆盖的最小区域。然后用移液器将100 µL封闭缓冲液（本实验中为用1×PBS稀释的马血清）加至切片上。将载玻片在室温下孵育1小时。随后用移液器移除封闭缓冲液。

接下来，将一抗与封闭缓冲液按1:100的比例稀释：在1.5 mL离心管中加入990 µL用1×PBS稀释的马血清，再加入10 µL一抗。每张切片加入100 µL稀释后的一抗，室温孵育30分钟。计时器响起后，倾去每张切片上的一抗溶液，然后用250 mL的1×PBS洗涤5分钟。使用新鲜的1×PBS重复洗涤一次。

当玻片在1× PBS中洗涤时，取995微升封闭缓冲液加入1.5 mL离心管中，再加入5微升二抗（本实验中为生物素标记的马抗小鼠IgG），配制成1:200稀释液。每张切片上加100微升稀释后的二抗，室温孵育30分钟。30分钟后，倾去切片上的二抗，然后将玻片置于250 mL 1× PBS中洗涤5分钟。更换新鲜的1× PBS重复洗涤一次。

现在，加入100 µL的亲和素-生物素复合物试剂，在室温下避光孵育30分钟。接着，将切片浸入250 mL的1×PBS中，洗涤5分钟。与之前的洗涤步骤类似，使用新鲜的1×PBS再重复洗涤一次。随后，加入100 µL DAB溶液，孵育最多5分钟以显色。最后，将切片浸入250 mL蒸馏水中5分钟，以终止显色反应。

现在可根据需要对切片进行复染。操作时，将切片短暂浸入 250 mL 哈里斯苏木精溶液中。用 250 mL 蒸馏水清洗切片 5 分钟，以去除复染液。使用新鲜蒸馏水再重复清洗一次。接下来，对组织切片进行脱水。首先将切片在 95% 乙醇中孵育 5 分钟。用纸巾轻轻吸干切片，然后将其转移至另一容器中的新鲜 95% 乙醇中，继续孵育 5 分钟。随后按照所示溶液依次进行洗涤、用纸巾吸干并转移切片至新溶液的操作循环，每种溶液中各处理 5 分钟。

最后一次孵育后，用纸巾轻轻吸去切片上的液体，然后在切片上滴加一滴封片介质，例如柠檬烯有机封片剂。接着，将盖玻片覆盖在组织切片上，注意避免产生气泡。此时切片已准备好，可置于显微镜下进行观察与分析。

为观察染色切片，使用标准光学显微镜观察染色结果，并使用数码相机采集图像。在此特定的免疫组化（IHC）示例中，通过比较野生型小鼠与自发性双转基因（DTG）小鼠的脾组织，研究淋巴瘤中Dyclin D1的表达情况。组织经石蜡包埋、切片后，使用抗cyclin D1抗体染色，并在20倍放大倍数下成像。表达cyclin D1的细胞在蓝色组织背景下呈现红褐色。通过比较不同小鼠来源图像中的染色强度，非增大的脾脏中cyclin D1表达量相对较低，且不受小鼠基因型影响。相比之下，DTG小鼠的增大脾脏显示出增强的红褐色染色，表明在此小鼠模型中，癌症发展与cyclin D1表达之间存在相关性。