共聚焦荧光显微镜技术：一种用于确定小鼠成纤维细胞中蛋白质定位的方法

1. 材料

缓冲液

1. 洗涤缓冲液：不含钙和镁的1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）
2. 固定缓冲液：含1%多聚甲醛的PBS
3. 透化缓冲液：含0.1% Triton X-100的PBS
4. 封闭缓冲液：含1%牛血清白蛋白的PBS
5. 细胞培养基：DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺

仪器设备

6. 层流罩
7. 恒温恒湿培养箱（37°C，5% CO₂）
8. 共聚焦激光扫描显微镜；此处使用的是尼康 Eclipse Ti 激光显微镜

材料与试剂

9. 带腔室的细胞培养载玻片
10. 含DAPI的抗荧光淬灭封片介质（用于细胞核染色）
11. 显微镜盖玻片
12. 无尘擦拭纸
13. 移液器及吸头

特定检测用试剂

14. 贴壁细胞（原代细胞或细胞系）；此处使用转染了 CD1d 的小鼠成纤维细胞（LCD1）。
15. 用于检测细胞靶标的初级抗体；此处使用大鼠抗小鼠 CD107a（LAMP-1）和小鼠抗小鼠 CD1d 抗体。
16. 针对初级抗体同种型的荧光染料标记的二抗；此处使用与 Alexafluor 488 偶联的抗大鼠 IgG 和与 Alexafluor 647 偶联的抗小鼠 IgG。

2. 实验方案

抗体染色前的准备

接种细胞

1. 用培养基重悬目标细胞。
2. 随后，将500 µL细胞悬液/孔接种至4孔细胞培养板的各孔中。（此处，将LCD1细胞以每孔2.5×10⁵个细胞的密度接种于500 µL培养基中。不同细胞系的接种密度可能有所不同）。
3. 将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中过夜孵育，使细胞贴附于玻片表面。
4. 次日，吸除各孔中的培养基，然后用500 µL PBS洗涤细胞1次。

固定

5. 为固定细胞，向每个孔中加入 500 µL 1% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟。
6. 孵育结束后，将多聚甲醛收集至适当的危险液体废物容器中。
7. 然后用 500 µL PBS 洗涤细胞 3 次，以去除固定剂的残留物。

透化

8. 在室温下用 500 µL 通透缓冲液/孔孵育细胞 15 分钟，以进行细胞通透处理。
9. 随后用 500 µL PBS 短暂洗涤细胞 3 次。

封闭

10. 每孔加入 500 µL 封闭缓冲液，在 4°C 下孵育 1 小时，以阻断非特异性抗体结合。

一抗孵育

11. 吸出玻片腔室中的封闭缓冲液。
12. 然后向细胞中加入 500 µL 稀释后的一抗溶液。（此处，抗 CD107a (LAMP-1) 抗体按 1:500 稀释，抗 CD1d 抗体未稀释使用（1H6 单克隆抗体由 Dr. Randy Brutkiewicz 惠赠））。
13. 将玻片于 4°C 条件下孵育过夜。

注意：如果同时检测多个靶标，请确保一抗属于不同的同种型。推荐的抗体浓度因生产商而异，使用前应进行滴定。

二抗孵育

14. 吸出各孔中的第一抗体溶液。
15. 用 500 µL PBS 洗涤孔腔 4 次。
16. 然后，向每孔加入 500 µL 稀释后的第二抗体溶液。（此处，第二抗体 anti-mouse IgG Alexafluor 647 和 anti-rat IgG Alexafluor 488 均用封闭缓冲液按 1:2000 比例稀释）。
17. 室温避光孵育 1 小时。
18. 孵育结束后，吸出第二抗体溶液。
19. 用 500 µL PBS 洗涤孔腔 4 次，以去除未结合的第二抗体。

注意：推荐的抗体浓度因生产厂家而异，使用前应进行滴定。若同时检测多个靶标，二抗必须偶联具有独特激发/发射光谱的不同荧光染料。选择荧光染料时，还需考虑核复染剂（如 DAPI）的激发/发射光谱。共聚焦显微镜的激光器配置可能影响荧光染料的选择，仪器的激光配置将决定哪些荧光染料适用于该实验。

3. 盖玻片封片

1. 首先，小心地将腔室从载玻片上移除。
2. 然后，将载玻片倾斜置于一张精细擦拭纸上，从边缘去除液体，注意不要触碰细胞。
3. 向每部分细胞区域滴加一滴含有细胞核染料 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。
4. 接着，用指尖捏住盖玻片边缘，将其覆盖在载玻片上，尺寸为 20 mm × 60 mm。（避免在细胞区域形成气泡，以免影响成像）。
5. 用精细擦拭纸擦去侧面多余的封片剂，并将载玻片置于避光环境中，室温保存，最长可保存一周。

4. 共聚焦成像

在共聚焦激光扫描显微镜上获取的图像样本。图2所示数据使用尼康Eclipse Ti A1R显微镜配合NIS Elements Advanced Research软件采集。下文详述使用上述软件进行图像采集的操作步骤。

1. 开始成像细胞时，点击“NIS软件图标”打开“NIS Elements Advanced Research软件”。
2. 接着，在控制窗口中点击“TiPad”选项卡，并选择用于成像的物镜。（此处首先使用了40倍物镜）。
3. 将载有细胞的玻片加载到载物台上，并将其居中置于物镜下方。
4. 现在，在“A1plus Compact GUI”选项卡中，根据所用荧光染料设置相应的激光器。点击齿轮图标以打开染料和光谱设置菜单，选择所需的通道，并为每个通道设置对应的激光器。
5. 然后，在第一个二向色镜下方的下拉菜单中选择适当的发射波长。
6. 接下来，在“A1plus Compact GUI”窗口中点击“Ch. Series”，以设置扫描线通道序列，该设置决定所用激光器是同时还是依次照射样品。（此处选择了顺序扫描，依次为通道1、通道2，然后是通道4）。
7. 之后，点击顶部的“箭头尖端”图标开始扫描。在实时成像过程中，在“A1plus Compact GUI”窗口中点击滑动条，调整针孔大小，以确保排除离焦光线。（此处使用了最低可用设置（0.5））。
8. 接着，通过滑动条调节每个激光器下的“高压”和“偏移”设置至适当水平，以便在检测特异性染色的同时尽量减少潜在的背景染色。如果有阳性染色样本，可先对每个通道成像该样本，以确保激光设置获得最佳信噪比。
   注意：长时间使用高激光强度可能导致光漂白。
9. 在为每个激光器设置好最佳的高压和偏移值后，点击“ND Acquisition选项卡”，然后选择“Z”图标以设置z序列参数。接着，在获取样品实时图像的同时，首先通过找到图像底部并点击“底部”按钮来设定下限，再找到样品顶部位置并点击“顶部”按钮设定上限。可通过直接输入每步所需的步长（单位为µm）或指定总步数来设置步长大小。
10. 设置完z序列参数后，选择所需图像的尺寸/像素分辨率。为此，请点击“A1plus Compact GUI”窗口，在“尺寸”图标下选择所需的分辨率。为降低图像噪声，可在“ø”符号旁的下拉菜单中选择图像平均次数。
11. 现在，点击“ND Acquisition菜单”中的“立即运行”选项卡，以开始对样品进行成像。
12. 成像完成后，点击“文件”，然后选择“另存为”，将图像文件以“.nd2”扩展名导出。最后，对其他每个样品重复上述过程。