基于免疫沉淀的技术：利用琼脂糖微珠纯化内源性蛋白质

1. 使用 Protein A/G PLUS 琼脂糖珠进行免疫沉淀

细胞裂解液的制备

1. 将10⁸个胸腺细胞在微量离心机中以13,000 rpm离心3分钟，弃上清液。
   注意：细胞数量将根据目标蛋白的表达水平和所选细胞类型的不同而有所变化。
2. 用500 µL含PMSF的RIPA裂解缓冲液重悬细胞。
3. 使用涡旋振荡器进行数次快速脉冲以破碎细胞，然后用连接在注射器上的25 G针头反复抽吸裂解液数次。
   注意：避免产生气泡。对于较大的细胞类型，可使用21 G等较大针头。
4. 将细胞裂解液置于冰上孵育10分钟。
5. 在4°C条件下，以13,000 rpm离心裂解液15分钟。
6. 将上清液转移至新的、已标记的微量离心管中。

预清除

7. 向裂解液中加入 20 µL Protein A/G PLUS 琼脂糖珠和 1 µg 同型对照抗体（此处使用小鼠 IgG1 同型对照抗体）。
   注意：所用同型对照抗体的选择取决于后续免疫沉淀步骤中使用的靶蛋白特异性抗体。
8. 将裂解液混合物置于冷室（4°C）中的离心机旋转仪上孵育 30 分钟。
9. 在 4°C 条件下，以 3200 rpm 离心 30 秒。
10. 将预清除后的上清液转移至新的、已标记的 1.5 mL 微量离心管中。弃去沉淀。

蛋白质浓度测定

11. 通过进行Bradford法测定细胞裂解液的蛋白浓度。
12. 将1000 µL Bradford试剂分装至7个微量离心管中。
13. 向其中6个管中分别加入以下体积的BSA蛋白标准品（2 mg/mL）（表1）。

试管编号	BSA 体积 (μL) (2 mg/mL)	蛋白质浓度 (μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

表1： BSA 蛋白标准品用量

14. 在第7^th 加入1 µL预清除的裂解液至离心管中。
    注意： 为确保样本浓度处于检测方法的检测范围内，同时制备并分析1:2或1:5的裂解液稀释样本。
15. 将7个试管中的每种样品各取200 µL，分别加入平底96孔板的独立孔中，每种样品设三个复孔。
16. 在酶标仪上于595 nm处读取吸光度。
17. 在 Excel 中生成标准曲线，并计算预清除裂解液的蛋白浓度。

下拉

18. 标记两个新的1.5 mL微量离心管——一个为“对照组”，另一个为“实验组”，在本示例中为c-myc。
19. 将500 µg预清除裂解液加入上述每个管中。
    注意：此处使用的蛋白质量取决于目标蛋白的纯化需求量。
20. 用裂解缓冲液将每管的总体积补至500 µL。
21. 向实验组管中加入2 µg抗c-myc抗体，向对照组管中加入2 µg小鼠IgG1同型对照抗体。
    注意：抗体用量取决于抗体效价及目标蛋白的丰度。
22. 将各管置于4°C冷室中，在旋转仪上孵育2小时。
23. 向每管中加入20 µL Protein A/G PLUS琼脂糖珠。
    注意：建议使用剪去末端的移液器吸头，以避免损伤琼脂糖珠。
24. 在4°C冷室中，于旋转仪上孵育过夜。
    注意：根据目标蛋白和抗体的结合效率，此步骤时间可从1小时至过夜不等。
25. 在4°C条件下，以3200 rpm离心30秒，使琼脂糖珠沉淀。
26. 吸除每管中的上清液。
    注意：目标蛋白现已结合在琼脂糖珠上。
27. 用500 µL 1× Dulbecco's PBS缓冲液洗涤琼脂糖珠两次。
28. 在4°C条件下，以3200 rpm离心30秒。
    注意：如需更严格的洗涤，可使用更严格的缓冲液，例如RIPA缓冲液。
29. 吸除每管中的缓冲液。使用加样枪头去除琼脂糖珠表面残留的液体，并将珠子置于冰上以进行蛋白洗脱。
    注意：在本示例中，通过煮沸琼脂糖珠将蛋白洗脱至SDS-PAGE上样缓冲液中，用于后续Western blot分析。该方法适用于验证免疫沉淀结果或检测蛋白-蛋白相互作用。对于其他下游应用，如用于结构或酶学分析的蛋白纯化，则通常采用更复杂的系统（如表位标签，包括flag标签或myc标签），以避免抗体与目标蛋白一同被洗脱。

2. 通过蛋白质印迹分析验证免疫沉淀

SDS-PAGE 电泳：

1. 用含有β-巯基乙醇的20 µL SDS-PAGE上样缓冲液重悬珠子。
2. 在95 °C下煮沸样品5分钟。
3. 在室温下以13,000 rpm离心珠子10秒。
4. 使用凝胶加样吸头，小心吸取珠子中获得的样品，并将其加入4–15%梯度SDS-PAGE凝胶的加样孔中。
5. 除样品外，还需加样一孔蛋白ladder以及一孔预清除裂解液，作为上样对照。
6. 以100 V电压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部（约1小时）。

蛋白质印迹分析：

7. 制备 Western 印迹三明治结构，确保 PVDF 膜位于凝胶和红色阴极之间。
8. 在 100 V 条件下转移 1 小时。
9. 将膜置于 5 mL 封闭缓冲液中，室温下低速摇动孵育 1 小时，以封闭非特异性蛋白结合位点。
   注意： 对于较大尺寸的印迹膜，封闭缓冲液、一抗、二抗及洗涤液的用量可能需要相应增加。
10. 在封闭缓冲液中加入 5 mL 抗 c-myc 抗体，与印迹膜在 4°C 条件下低速摇动孵育过夜。
    注意： 此处使用的一抗应与 pull-down 步骤中所用抗体不同。
11. 使用 5 mL TBST 洗涤印迹膜 3–6 次，每次洗涤 5 分钟，室温下低速摇动。
12. 将印迹膜与 HRP 标记的抗兔轻链二抗在封闭缓冲液中孵育，室温下低速摇动 1 小时。
    注意： 二抗的选择取决于 Western 印迹中使用的一抗。本方案中选用轻链特异性二抗，是因为目标蛋白的分子量接近抗体的重链大小。若目标蛋白分子量接近 50 kDa，应使用轻链特异性二抗；若目标蛋白分子量接近 25 kDa，则应使用重链特异性二抗。
13. 使用 5 mL TBST 洗涤印迹膜 3–6 次，每次洗涤 5 分钟，室温下低速摇动。
14. 移除印迹膜上的液体，并用实验室擦拭纸轻蘸膜边缘以去除多余液体。
15. 用 1× 化学发光检测试剂覆盖印迹膜，孵育 1 分钟。
    注意： 以下步骤应迅速连续进行，因为检测试剂对光和时间敏感。
16. 用实验室擦拭纸轻蘸印迹膜边缘，去除多余的检测试剂。
17. 将印迹膜放置于成像仪托盘的成像表面上。
    注意： 化学发光印迹也可通过胶片进行检测。
18. 使用“化学发光程序”采集从 10 秒至 5 分钟的多个时间点图像。
    注意： 最佳曝光时间可能因蛋白量和抗体质量而异。
19. 选择条带可见度最佳的图像，并导出该图像。
20. 在移动印迹膜之前，使用成像仪拍摄印迹膜照片，以记录蛋白 Marker 的位置，然后也将该图像导出。
21. 使用幻灯片制作软件（如 PowerPoint），将条带图像与蛋白 Marker 图像对齐，合并为一张完整图像。