5.12: 细胞死亡测定:细胞毒性能力的铬释放测定

过程概述

用于测量细胞死亡的典型⁵¹Cr 释放测定涉及以下步骤:

1. 首先，目标细胞标有Na₂=⁵¹Cr_O₄。这使它们与测定中的效应细胞区分开来。
2. 当目标细胞进行标记时，收集效应细胞，并使用串行稀释技术，在圆底96孔测定板中生成效应细胞的滴定。
3. 在靶细胞标记的末尾，首先对细胞进行清洗，然后将固定数量的细胞添加到已经含有一系列效应细胞稀释的测定板中。
4. 接下来，目标效应细胞组合在规定的时间段内孵育，以允许与目标细胞进行足够的细胞交互，以调解细胞莱沙。
5. 最后，将培养超生物收获并收集到管中。⁵¹Cr 量使用伽玛计数器进行定量。
6. 最后，收集数据并用于计算目标细胞的"百分比特定细胞莱沙"。

1. 用⁵¹Cr 标记目标细胞

1. 首先，将目标细胞（此处-人类黑色素瘤细胞系WM793）制备成单个细胞悬浮液。
2. 为此，首先从组织培养瓶中取出介质。
3. 然后，用 5 mL 的 1X PBS 清洗细胞。
4. 通过在板中加入1 mL的胰蛋白酶，使细胞分氨酸2分钟。
5. 轻轻敲击烧瓶，将细胞从烧瓶表面松开。
6. 将 5 mL 的 RPMI 介质添加到烧瓶中，并上下移液介质以分离电池。
7. 将细胞悬浮液收集到15 mL锥形管中，并在1200 rpm转速下将细胞悬浮液离心5分钟。去上清。
8. 向颗粒中加入 10 mL 的介质，并轻轻上下移液介质，使电池悬浮。
9. 使用血细胞计确定细胞浓度。
10. 将 1x10⁶细胞转移到新的 15 mL 锥形管中。
11. 在 1200 rpm 转速下将细胞悬浮液离心 5 分钟，并排出上清液。
12. 短暂涡旋管，在留下的小体积中重新悬浮细胞颗粒。
13. 将 100 μCi^{的 51}Cr 直接添加到 WM793 目标细胞悬架中。
    注意:应该有一个专用的实验室空间，为特定的放射性设置。此外，在所有步骤中，应有足够的铅屏蔽，以便安全储存和使用⁵¹Cr，并配备适当的标牌，以指示存放⁵¹Cr 的样品的位置。盖革计数器也配有煎饼探头，用于测量空间是否可能存在污染。
14. 在管子里加一小块放射性胶带，表明管子现在具有放射性。
15. 将管子置于带有铅屏蔽的37°C培养箱中，孵育1小时。
16. 潜伏期后，用5 mL的FBS清洗目标细胞，以去除任何^多余的51克。
17. 在1200rpm下将细胞离心5分钟，将放射性FBS洗入适当的废物容器。
18. 用 FBS 重新悬浮颗粒并第二次清洗。使用盖革计数器检查颗粒中有有未包含的放射性。
19. 将颗粒重新悬浮在10 mL完整培养基中，达到10⁵细胞/mL的细胞浓度。
    注意:出于安全考虑，此处省略了⁵¹Cr 标签后的细胞计数步骤。可以假定WM793细胞浓度^与51Cr标签之前相同。

2. 制备效应细胞

1. 可以使用各种效应细胞，例如人或小鼠 T 细胞和 NK 细胞。在此示例中，使用通过标准密度梯度离心（浓度为5x10^6）从全血中分离出来的PBMC。
2. 首先，将100μL的组织培养基添加到96孔圆底板的一行（此处为A行，见表1）的每一口井中。在这里，没有添加效应细胞，它们将作为"空白"，用于确定目标细胞中的"最小/^自发51Cr释放"。

^表1:51Cr释放测定布局:A行-目标细胞（10⁴个细胞/100μL）仅用介质孵育（生成"空白"以确定"最小/^自发51Cr释放"）。 B 行到 C-孔包含不同的效应器:目标单元 （E:T） 比率，范围从 50:1 到 1.5:1。行H-靶细胞 （10⁴细胞/100 μL） 孵育与 1% NP-40 （NP-40 解压目标细胞， 产生"最大或总⁵¹Cr 释放"）。每个E:T比在每个实验条件下都以三倍率进行测试。列1-3-未刺激的 PBMC 和列4-6- CpG 刺激的 PBMC。

3. 接下来，生成 PBMC 的 2 倍串行细胞稀释（针对每个实验条件的三倍），以获得从 5x10⁵到 15，625 个细胞/100 μL 介质（此处为 B 到 G 行）的效果细胞浓度。
   注意:在此示例中，起始效应器:目标单元格 （E: T） 比率为 50:1。但是，此比率可以根据实验细节进行调整。
4. 通过不向这些井中添加任何效应单元，将最后一行留空（此处为第 H 行）。（此行将用于生成"总计数/分钟，或（c.p.m）"或"最大⁵¹Cr 释放"）。
5. 将板放入 37°C 培养箱中，直到目标细胞准备好添加。

3. 将^{51 个}Cr 标记 WM793 目标细胞添加到 Assay

1. 孵育期后，从培养箱中取出目标细胞，用5mL的FBS清洗，以去除任何^{多余的51Cr。}
2. 使用指定的离心机在 1200 rpm 下将细胞离心 5 分钟。
3. 将 FBS 洗涤液（放射性上清液）放入适当的废物容器中。
4. 将颗粒重新悬浮在 FBS 的新鲜 5 mL 中，重复洗涤步骤。
5. 在 1200 rpm 转速下再次离心，等待 5 分钟。
6. 最后，将颗粒重新悬浮在10 mL的完整介质中。
7. 将⁵¹Cr 标记的 WM793 细胞悬架 （10⁵细胞/mL） 倒入一次性试剂罐中。
8. 然后，使用多通道移液器，将这些标记的目标细胞的100μL添加到96孔效应器细胞板的每个孔中。
9. 接下来，在没有任何效应细胞的井中加入 100 μL 的 1% NP-40（在水中）（此处为 H 行）。1% NP-40 将解压目标细胞，因此这些井将作为控制，以确定"总计数/分钟，或（c. p.m）"或最大⁵¹Cr 释放。
10. 在板的两侧添加一小块透气胶带，并在盖子上放置一块放射性胶带，以指示其包含⁵¹Cr，从而将盖子固定到板上。
11. 简单地说，在 1200 rpm 转速下将板离心。如果只使用一个实验板，向离心机添加平衡板。
    注意:使用标有放射性样品的离心机非常重要。
12. 从离心机中取出板。
13. 将板放在 37°C 的培养箱中，在板上放一小块铅屏蔽，以保障安全性。孵育16小时，以允许目标细胞解说。
    注意:潜伏期可能从4小时到18小时不等，这取决于所使用的效应细胞和潜在的杀灭机制。

4. 收获超级动物

1. 在孵育期结束时，小心地取下板边缘周围的胶带并取下盖子。
2. 接下来，将收获框架放在板上，确保确认每个棉塞的小滤盘都已到位。这将确保收集无细胞上清液。
3. 现在，慢慢地轻轻地将棉塞压入井中。
4. 大约 10 秒后，释放棉塞上的压力，然后将棉塞转移到管条上。
5. 将每个管子放入辅助 FACS 管中。
6. 最后，将FACS管加载到伽玛计数器上，并运行样品，以定量每种条件下释放^的51克。样品通常测量 1 分钟，便于确定"计数/分钟"。
7. 仔细记录管子被装入柜台的顺序。

5. 数据分析

1. 在这里，未刺激的PBMC被添加到前三列，CpG刺激的PBMC（CpG ODN，（1微克/千米）24小时）被添加到列4-6。见表2。

表^2:51Cr 释放测定数据:"每分钟计数"/"c.p.m"数据值、平均 c. p. m 值以及计算特定莱沙值的百分比。

2. 收集的数据（每分钟计数，即 c.p.m）以与原始板中样本布局相同的方式输入电子表格的单元格。
3. 首先，计算了三元数的平均值。表2 - 细胞I3至P3，用于未刺激的PBMC和细胞I6到P6，用于CpG刺激的PBMC。
4. 一旦确定平均值，则使用以下公式计算每个条件的特定莱沙百分比-
   
   
5. 具体莱沙百分比针对每种情况计算（表 2 - 细胞 J4 到 O4，用于未刺激的 PBMC，J7 到 O7，对于未刺激的 PBMC）。

在本视频中，您将观察如何进行铬释放测定并确定效应细胞的细胞毒潜力。

免疫细胞负责从体内识别和清除潜在有害细胞，如癌症或病毒感染的细胞，这是免疫反应不可或缺的一部分。几种免疫细胞，如 T 细胞和 NK 细胞，具有称为细胞毒潜力的特性，即识别靶细胞并分泌诱导这些靶细胞蛋白质降解、裂解和死亡的蛋白质的能力。量化细胞毒性潜力对于测量免疫细胞活化和效力至关重要，铬释放测定通常用于此目的。

该方法使用户能够比较特定类型免疫细胞在不同条件下诱导的细胞毒性，这对于研究癌症免疫治疗和免疫相关疾病很有价值。首先，靶细胞（如癌细胞）与放射性同位素 51 一起孵育，铬 51 被细胞吸收。接下来，将这些放射性标记的细胞与分离的目标免疫细胞（也称为效应细胞）在圆底 96 孔板中共培养，以促进两种细胞类型之间的相互作用。

该检测的整体设置包括将特定数量的靶细胞与不同浓度的免疫细胞以及适当的对照一起孵育。共培养允许效应细胞在靶细胞中诱导细胞凋亡和裂解，导致细胞内铬 51 释放到上清液中。然后，在预先优化的时间点，从所有孔中收获含有释放的铬的上清液。铬 51 具有放射性，自发发生放射性衰变以发射伽马辐射。检测板中所有孔的上清液中的 γ 辐射水平代表靶细胞裂解的可量化输出。这是使用 γ 计数器测量的，然后用于确定免疫细胞的细胞毒性潜力。

首先，将靶细胞（本例中为人黑色素瘤细胞系 WM793）制备成单细胞悬液。为此，首先从组织培养瓶中取出培养基，并用 5 mL 1X PBS 洗涤细胞。倒出 PBS，然后向板中加入 1 毫升胰蛋白酶，反应约 2 分钟。轻轻敲击培养瓶，使细胞从培养瓶表面松开，然后向培养瓶中加入 5 mL RPMI 培养基。上下移液培养基以收集细胞，并将该悬浮液添加到 15 mL 锥形管中。

将试管放入离心机中，以 1200 RPM 的速度放置 5 分钟。接下来，从试管中取出培养基，确保不要破坏细胞沉淀。轻轻轻弹试管底部以破坏细胞沉淀，并向试管中加入 10 毫升培养基。然后，轻轻上下移液培养基，使细胞进入悬浮状态。接下来，使用血细胞计数器测定细胞浓度，并将 2 毫升原始细胞悬液转移到新的 15 毫升锥形管中。将试管放入离心机中，以 1200 RPM 的速度沉淀细胞 5 分钟。离心后，将多余的培养基从试管中倒入废液容器中。短暂涡旋试管，将细胞沉淀重悬于留下的少量培养基中。

接下来，通过转移到专门用于这种特定放射性的实验室空间来准备使用 Chromium 51。在所有步骤中，应有足够的铅屏蔽层，以便安全储存和使用铬 51，并有适当的标志来指示含有铬 51 的样品的保存位置。还需要配备煎饼探头的盖革计数器，以便在空间内用于可能的污染。

设置好放射性的正确使用后，将 100 微居里 51 铬直接添加到目标细胞悬液中。然后，在试管中加入一小块放射性胶带，以表明样品和试管现在具有放射性。将试管放入带有铅屏蔽罩的 37 摄氏度培养箱中，孵育一小时，每 15 到 20 分钟轻弹一次试管。

在标记靶细胞的同时，制备效应细胞的单细胞悬液。在这个例子中，通过标准密度梯度离心从全血中分离出人外周血单核细胞 （PDMC） 至浓度为 5 乘以 10 至 6。将该效应细胞悬液转移到一次性试剂储液槽中，然后将 200 μL 该悬浮液添加到 96 孔圆底板中 B 行的每个孔中。接下来，向板的 C 行到 G 行的每个孔中加入 100 微升 RPMI。

现在，开始对 PBMC 进行连续稀释，以获得一系列效应细胞数量，方法是首先去除 B 行孔中的 100 微升细胞并将其添加到 C 行。然后，通过将 100 微升细胞从 C 行转移到 D 行来进一步稀释效应细胞。继续连续稀释。到达 G 行后，从孔中移出 100 μL，在该行的每个孔中留下 100 μL 的最终体积。接下来，向 A 行的孔中加入 100 微升组织培养基，以作为目标细胞自发释放 Chromium 51 的对照，因为不应将效应细胞添加到该行中。然后，将板放入 37 摄氏度的培养箱中，直到准备好添加目标细胞。

孵育期后，从培养箱中取出目标细胞，并用 5 毫升 FBS 洗涤以去除任何多余的 Chromium 51。然后，将试管放入指定的离心机中，以 1200 rpm 离心 5 分钟。将放射性 FBS 洗涤液取出到适当的废液容器中，然后将沉淀重悬于新鲜的 5 ml FBS 中，重复洗涤步骤。将试管放入指定的离心机中，以 1200 rpm 的转速再次离心细胞 5 分钟。去除第二次洗涤液，并使用盖革计数器检查沉淀物是否掺入放射性。最后，将沉淀重悬于 10 mL 完全培养基中，并将 Chromium 51 标记的目标细胞悬液倒入一次性试剂储液槽中。然后，将 100 微升这些标记的靶细胞添加到 96 孔效应细胞板的每个孔中。接下来，将 100 微升 1% NP-40 水溶液加入 H 行的孔中，以裂解每行的所有目标细胞。这些孔将用作对照来确定每分钟总计数 （cpm）。

现在板已准备好，通过在板的每一侧添加一小块胶带来固定盖子，并在盖子上放置一条放射性胶带以表明它含有铬 51。然后，将板放入标有放射性样品的离心机中。如果仅使用一个实验板，请在离心机中添加平衡板。将离心机设置为 1200 rpm，并使板加速。一旦达到速度，就停止机器。从离心机中取出板。然后，将板放入 37 摄氏度的培养箱中，并在板上覆盖一小块铅屏蔽层，以提高安全性。孵育 16 小时，让靶细胞裂解。

孵育期结束时，小心地撕下板边缘的胶带，然后取下盖子。接下来，将收获架放在板上，确保确认每个棉栓的小过滤盘都已就位。现在，慢慢地轻轻地将棉塞压入孔中。大约 10 秒后，松开棉塞上的压力，然后将棉塞转移到试管条上。将这些管中的每一个放入二级 FACS 管中。最后，将 FACS 管加载到 γ 计数器上并运行样品以定量在每种条件下释放的铬 51 的量。仔细记录试管装入计数器的顺序。

在这里，未刺激的 PBMC 被添加到前 3 个泳道中，CPG 刺激的 PMBC 被添加到泳道 4 至 6 中。在此示例中，将每分钟计数输入电子表格的单元格中，其方式与在原始板中布置样品的方式相同，并计算一式三份的平均值。例如，对于第一个条件，单元格 A1、A2 和 A3 在单元格 I3 中取平均值。一旦确定了平均值，就可以使用此公式计算每种情况的特异性裂解百分比。例如，为了计算效应细胞与靶细胞之比为 50：1 的未刺激细胞的特异性裂解百分比，从实验 CPM 1129 中减去自发 CPM（在本例中为 1164.67）。67. 然后可以将这个数字除以最大 CPM 和自发 CPM 之间的差值，然后乘以 100 得到特异性裂解百分比。然后为每个条件计算此值。然后可以将这些数据绘制成图表，以显示未刺激的 PBMC 和 CPG 刺激的 PBMC 的 E 与 T 比率与特异性裂解百分比的比较。在这个例子中，随着效应细胞与靶细胞的比例增加，用 CPG 刺激的效应细胞更有效地杀死了靶细胞。在未刺激的 PBMC 中未观察到这种增加，表明 CPG 刺激对于观察到的靶细胞裂解增加是必要的。