细胞死亡检测：细胞毒性能力的铬释放检测

操作概述

用于测量细胞死亡的典型⁵¹Cr释放实验包括以下步骤：

1. 首先，用 Na₂[⁵¹Cr]O₄ 标记靶细胞，以在实验中将其与效应细胞区分开来。
2. 在靶细胞标记的同时，收集效应细胞，并利用连续稀释法，在圆底 96 孔检测板中制备一系列浓度递减的效应细胞稀释液。
3. 靶细胞标记结束后，先对细胞进行洗涤，然后将固定数量的靶细胞加入已含有系列稀释效应细胞的检测板中。
4. 接着，将靶细胞-效应细胞混合物在一定时间内孵育，以允许效应细胞与靶细胞充分相互作用，介导靶细胞裂解。
5. 最后，收集培养上清液至离心管中，使用γ计数器定量测定其中的⁵¹Cr 含量。
6. 最终，收集数据并用于计算靶细胞的“特异性细胞裂解百分率”。

1. 使用⁵¹Cr标记靶细胞

1. 首先，将靶细胞（此处为人类黑色素瘤细胞系 WM793）制备成单细胞悬液。
2. 为此，先从组织培养瓶中移除培养基。
3. 然后用 5 mL 的 1× PBS 清洗细胞。
4. 通过向培养皿中加入 1 mL 胰蛋白酶，作用约 2 分钟，使细胞消化。
5. 轻轻敲击培养瓶，使细胞从瓶壁上松脱。
6. 向培养瓶中加入 5 mL RPMI 培养基，并用移液器反复吹打，使细胞完全脱离。
7. 将细胞悬液收集至 15 mL 圆锥管中，在 1200 rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
8. 向细胞沉淀中加入 10 mL 培养基，轻轻吹打混匀，使细胞重悬。
9. 使用血细胞计数板测定细胞浓度。
10. 将 1×10⁶ 个细胞转移至新的 15 mL 圆锥管中。
11. 在 1200 rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
12. 短暂涡旋振荡管子，使细胞沉淀在残留的少量培养基中重新悬浮。
13. 向 WM793 靶细胞悬液中直接加入 100 µCi 的 ⁵¹Cr。
    注意：应设有专门的实验区域用于处理放射性物质。此外，在所有操作步骤中，均需配备充足的铅屏蔽以安全储存和使用 ⁵¹Cr，并设置适当的警示标识，标明含 ⁵¹Cr 样品的存放位置。还需配备带有平板探头的盖革计数器，用于检测实验区域是否存在放射性污染。
14. 在管壁上贴一小块放射性警示胶带，以标明该管已具有放射性。
15. 将试管置于带有铅屏蔽的 37°C 培养箱中孵育 1 小时，每隔 15–20 分钟轻轻振荡试管，以促进靶细胞对铬的摄取。
16. 孵育结束后，用 5 mL 胎牛血清（FBS）清洗靶细胞，以去除未结合的 ⁵¹Cr。
17. 在 1200 rpm 条件下离心 5 分钟，将具有放射性的 FBS 洗液倒入适当的放射性废物容器中。
18. 将细胞沉淀重悬后，再次用 FBS 洗涤一次。使用盖革计数器检测细胞沉淀中的放射性掺入情况。
19. 将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全培养基中，调整细胞浓度至 10⁵ 个细胞/mL。
    注意：出于安全考虑，此处省略了 ⁵¹Cr 标记后的细胞计数步骤。可假设 WM793 细胞浓度与 ⁵¹Cr 标记前相同。

2. 效应细胞的制备

1. 可使用多种效应细胞，例如人或小鼠的T细胞和NK细胞。本示例中，使用通过标准密度梯度离心法从全血中分离得到的外周血单个核细胞（PBMCs，浓度为5×10⁶）。
2. 开始时，向96孔圆底板的一整行（此处为A行，见表1）每孔加入100 µL组织培养基。此处不添加效应细胞，用于作为空白对照，以测定靶细胞的“最低/自发⁵¹Cr释放”。

表1：⁵¹Cr释放实验设计： 第A行：靶细胞（10⁴ 个细胞/100 µL）仅与培养基共同孵育（用于测定“空白”值，即“最低/自发性⁵¹Cr释放”）。第B至C行：包含不同效应细胞与靶细胞（E:T）比例的孔，比例范围从50:1至1.5:1。第H行：靶细胞（10⁴ 个细胞/100 µL）与1% NP-40共同孵育（NP-40可裂解靶细胞，产生“最大或总⁵¹Cr释放”）。每种实验条件下，每个E:T比例均设置三个重复孔。第1-3列：未刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）；第4-6列：经CpG刺激的PBMCs。

3. 接下来，对 PBMC 进行 2 倍系列稀释（每种实验条件设三个重复），以获得效应细胞浓度从 5×10⁵ 至 15,625 个细胞/100 µL 培养基的稀释梯度（此处为 B 至 G 行）。
   注意： 本示例中，初始效应细胞:靶细胞（E:T）比例为 50:1。但该比例可根据具体实验条件进行调整。
4. 最后一行不加入任何效应细胞（此处为 H 行），保持空白（该行将用于生成“总计数/分钟”（c.p.m）或“最大 ⁵¹Cr 释放量”）。
5. 将培养板放入 37°C 培养箱中孵育，直至靶细胞准备就绪待加入。

3. 将⁵¹Cr标记的WM793靶细胞加入检测体系

1. 孵育结束后，将靶细胞从培养箱中取出，加入 5 mL 胎牛血清（FBS）洗涤，以去除多余的 ⁵¹Cr。
2. 使用指定的离心机，以 1200 rpm 离心 5 分钟。
3. 将 FBS 洗涤液（放射性上清）转移至适当的废液容器中。
4. 通过将细胞沉淀重悬于 5 mL 新鲜 FBS 中，重复洗涤步骤。
5. 再次以 1200 rpm 离心 5 分钟。
6. 最后，将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全培养基中。
7. 将 ⁵¹Cr 标记的 WM793 细胞悬液（10⁵ 个细胞/mL）倒入一次性试剂储液槽中。
8. 然后使用多通道移液器，向 96 孔效应细胞板的每孔中加入 100 μL 上述标记的靶细胞。
9. 接下来，向不含效应细胞的孔行（此处为 H 行）加入 100 μL 1% NP-40（溶于水）。1% NP-40 可裂解靶细胞，因此这些孔作为对照，用于测定“总计数/分钟（c. p. m）”或最大 ⁵¹Cr 释放量。
10. 通过在板的两侧各贴一小块透气胶带固定板盖，并在盖上贴放射性警示胶带，以标明其含有 ⁵¹Cr。
11. 短暂地以 1200 rpm 离心该板。若仅使用一块实验板，需在离心机中加入配平板。
    注意：必须使用标记为可处理放射性样品的离心机。
12. 从离心机中取出板。
13. 将板放入 37°C 培养箱中，并在板上方放置一小块铅屏蔽以增强安全性。孵育 16 小时，以允许靶细胞发生裂解。
    注意：孵育时间可根据所用效应细胞及其潜在杀伤机制的不同，在 4 至 18 小时之间调整。

4. 收集上清液

1. 孵育结束后，小心移除平板边缘的胶带并打开盖子。
2. 接着将收集架放置在平板上，确保每个棉塞下方的小滤膜圆片均已就位，以保证获得无细胞上清液。
3. 现在，缓慢而轻柔地将棉塞压入各孔中。
4. 约10秒后，松开对棉塞的压力，然后将棉塞转移至管条中。
5. 将每个管子放入一个次级FACS管中。
6. 最后，将FACS管装载到γ计数器上，运行样品以定量每种条件下释放的⁵¹Cr量。通常每份样品测量1分钟，便于直接确定“每分钟计数（counts/minute）”。
7. 仔细记录管子装入计数器的顺序。

5. 数据分析

1. 此处，未刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）被加入前三个孔，而经CpG刺激的PBMCs（CpG ODN，(1 µg/mL) 刺激24小时）被加入第4至6列。参见表2。

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
I	A1、A2、A3 的平均值 ->		1164.67	自发计数每分钟（c.p.m）		1058.33
J	B1、B2、B3 的平均值 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	C1、C2、C3 的平均值 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	D1、D2、D3 的平均值 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	E1、E2、E3 的平均值 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	F1、F2、F3 的平均值 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	G1、G2、G3 的平均值 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	H1、H2、H3 的平均值 ->		8884.67	最大计数每分钟（c.p.m）		8885.67
				未刺激的外周血单个核细胞（PBMC）			CpG 刺激的外周血单个核细胞（PBMC）	效应细胞与靶细胞比例（E:T 比例）

表2：⁵¹Cr释放实验数据：“每分钟计数”（c. p. m.）的数值、平均c. p. m.值以及计算得到的特异性裂解百分比值。

2. 将收集的数据（每分钟计数，即 c.p.m）按照样本在原始培养板中的排列方式输入电子表格的相应单元格中。
3. 首先计算三个重复样本的平均值。未刺激的 PBMCs 对应表 2 中的 I3 至 P3 单元格，CpG 刺激的 PBMCs 对应 I6 至 P6 单元格。
4. 确定平均值后，使用以下公式计算每种条件下的特异性裂解百分比：
   
   
5. 针对每种条件计算特异性裂解百分比（未刺激的 PBMCs 对应表 2 中的 J4 至 O4 单元格，CpG 刺激的 PBMCs 对应 J7 至 O7 单元格）。