Name: 视网膜水平切片制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习一种新型视网膜水平切片制备方法，用于保护神经元树突形态并改善视网膜回路功能研究。该技术为神经科学和视觉处理机制研究提供了可靠的替代方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Richard H. Masland博士和Akimichi Kaneko博士为我们建立视网膜水平切片制备方法提供了宝贵的建议和指导。

<ol>
<li>制备琼脂块（30 mg/ml，即 3%，溶于蒸馏水中）。先将其溶解并用微波炉加热，然后倒入玻璃皿中。将玻璃皿置于 4 oC 的冰箱中保存。 提示：琼脂块应提前制备。 </li>
<li>制备低熔点琼脂糖凝胶（25 mg/ml，即 2.5%，溶于培养基中）。将其溶解并用微波炉加热，然后置于 35 oC 的水浴中保温。 提示：琼脂糖凝胶温度不宜过高。若温度过高，凝固时间将延长，且可能损伤视网膜。 </li>
<li>处死动物，摘除眼球并将其打开成眼杯状。如需要，将打开的眼杯浸入含透明质酸酶（0.07 mg/ml）的培养基中 10 分钟，以液化玻璃体。 </li>
<li>将琼脂切成一块（例如，小鼠视网膜可用 1 cm × 1.5 cm 大小），用瞬干胶牢固地固定在振动切片机的载物台上。保持琼脂块湿润。 </li>
<li>将切片刀角度设为 5 度。以约 50 µm/sec 的速度、50 Hz 的频率，轻轻切削琼脂块的顶面。 提示：确保琼脂块顶面完全光滑平整。可能需要进行数次切割（至少 3 次）以获得光滑平整的表面。 </li>
<li>用不含透明质酸酶的培养基冲洗眼杯。从色素上皮上分离出视网膜，并将其感光细胞面朝下放置在滤纸片上。为牢固地将视网膜贴附于滤纸上，需在滤纸上多次抽吸真空。 提示：确保视网膜完全平整地贴附在滤纸上。将视网膜置于滤纸上后，剪除视网膜周围多余的滤纸（图 2A）。多余的滤纸常会阻碍刀片进入视网膜的适当层次。 </li>
<li>轻轻擦去琼脂块表面多余的培养基，小心地将带有视网膜的滤纸放置在琼脂块上。为牢固固定滤纸，可在滤纸边缘涂抹瞬干胶。 提示：为避免意外裂纹，应尽可能将视网膜放置在琼脂块顶面的前端位置。 </li>
<li>轻轻将低熔点琼脂糖凝胶倒在视网膜上。等待 1 分钟后，再轻轻加入培养基以冷却。琼脂糖凝胶会迅速凝固。 提示：过热的琼脂糖凝胶会杀死视网膜。 </li>
<li>将刀片位置抬高至琼脂块顶面上方数百 µm 处，轻轻切去凝固的琼脂糖凝胶顶部。 </li>
<li>降低刀片位置。在内核层近端三分之一水平（约在琼脂块顶面上方 200 至 250 µm 之间）切开视网膜。 提示：刀片速度过快会严重损伤视网膜。约 50 µm/sec（50 Hz）较为合适。 </li>
<li>注意此时无长突细胞已朝下。小心地将连同凝固琼脂糖凝胶的视网膜切片取出，并正面朝上置于孵育 chamber 或培养皿中。 提示：由于小鼠视网膜体积小且呈波浪状，难以在适当层次获得完美的水平切片。“斜切”方法可作为替代方案以获得相对平坦的视网膜切片。为实现斜切，可在滤纸上的视网膜与琼脂块之间插入另一张滤纸，如图 2B 所示。尽管无法获得完美的水平切片，但总会有部分区域的无长突细胞胞体位于切片表面。 </li>
</ol>

<ol><li>Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+spatiotemporal+patterns+of+dendritic+Ca2%2B+signals+in+goldfish+retinal+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells.</a> Brain Res. , 64-73 (2004).</li>
<li>Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+currents+stabilize+the+membrane+potential+in+dendrites+of+mouse+amacrine+cells%3A+patch-clamp+recordings+and+single-cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell.</a> , 328-340 (2004).</li>
<li>MA, M. acN. eil, RH, M. asland <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. , 971-982 (1998).</li>
</ol>

所有实验方案均按照美国国立卫生研究院关于动物使用的指南进行。

视网膜水平切片制备具有多个重要优势。
首先，能够水平延伸树突的细胞（如无长突细胞和水平细胞）的形态得以保留。研究表明，视网膜中存在超过20种类型的无长突细胞（MacNeil 和 Masland，1998），因此将细胞形态与其生理特性进行比较显得尤为重要。
其次，在整体视网膜中，胶质细胞终足的广泛覆盖阻碍了膜片钳电极对无长突细胞的接触。而在水平切片中，无长突细胞的胞体暴露于切片表面。
 第三，由于细胞及其树突位于切片表面，化学试剂可轻易到达靶细胞及其树突。化学物质的灌注和清除快速且简便。
 第四，可以进行荧光离子成像，例如常规的钙成像。在传统的垂直切片或整体视网膜标本中，成像所用的激发光本身会激活感光细胞。而在水平切片制备中，感光细胞和感光色素被完全去除，因此不会产生由激发光引发的伪迹干扰。此外，由于消除了感光细胞的背景活动，成像的信噪比显著提高。水平切片制备最大的缺点是感光细胞与节细胞之间的垂直连接被切断，因...

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1296</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖 L</td><td>和光纯药工业株式会社</td><td>317-01182</td><td>低熔点琼脂糖</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>I-S 型，300 U/mg</td></tr><tr><td>培养基</td><td></td><td></td><td>单位为 mM：102 NaCl、3.1 KCl、2.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、1.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、23 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 和 10 葡萄糖，pH 维持在 7.8；或 Ames&amp;rsquo; 溶液（Sigma）</td></tr><tr><td>微波炉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温水浴</td><td></td><td></td><td>35 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>膜过滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>滤纸，孔径 0.45 &amp;#181;m</td></tr><tr><td>解剖工具</td><td></td><td></td><td>镊子、刀片、持针器、尖头镊等&lt;em&gt;etc&lt;/em&gt;。</td></tr><tr><td>速干胶</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alonalpha、Krazy Glue</td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr></tbody></table>

视网膜水平切片制备

Horizontal Slice Preparation of the Retina

传统上，研究视网膜神经回路功能常采用视网膜垂直切片和整体装片制备方法。然而，许多视网膜神经元（如无长突细胞）的树突呈水平方向延伸，因此在垂直切片中其细胞形态可能受到严重破坏。而在整体装片制备中，尤其是进行膜片钳记录时，由于胶质细胞（Müller细胞）终足广泛覆盖，视网膜中层的神经元难以接近。本文介绍一种新型切片方法，可完整保存视网膜神经元的树突形态。该方法将视网膜包埋于低温熔点琼脂糖凝胶后，使用振动切片机在视网膜内层进行水平切片。在此视网膜水平切片制备中，我们结合膜片钳记录、钙成像技术、免疫细胞化学和单细胞RT-PCR，对视网膜神经元的功能与其形态进行了联合研究。

关键词：视网膜，水平切片，振动切片机，树突形态，膜片钳记录，钙成像，免疫细胞化学，单细胞RT-PCR

传统上，视网膜的垂直切片和整体装片制备方法被用于研究视网膜神经环路的功能。本文中，我们描述了一种新型切片方法，可完整保存视网膜神经元的树突形态。

传统上，视网膜垂直切片和整体装片制备方法被用于研究视网膜神经环路的功能。然而，许多……

因此，传奇已至，这是一篇图文并茂的文章。

horizontal-slice-preparation-of-the-retina

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

非人灵长类动物在我们理解发育和衰老过程中是一个重要的转化研究物种。灵长类动物视网膜的解剖结构可能为人类正常及病理状态提供重要见解。...

通往大脑之门：灵长类眼球的解剖

本文介绍了一种制备小鼠视网膜暗适应切片以进行电生理记录的实验方法。...

小鼠视网膜神经元在暗适应脑片制备中的膜片钳记录

我们描述了从水生虎纹蝾螈（Ambystoma...

在两栖动物视网膜切片标本中对光感受器与二级神经元进行全细胞同步记录

将一只8天大的小鼠的神经视网膜置于4%明胶块上。通过振动切片机分离出200...

使用振动切片机切分小鼠视网膜以制备感光细胞培养物

我们将演示如何从小鼠眼球制备视网膜切片，并记录视网膜神经元的光反应。整个操作均在暗适应条件下进行。...

使用膜片钳技术在暗适应小鼠视网膜切片制备中记录神经元的光诱发突触后反应

我们描述了一种利用小鼠视网膜的ex-vivo 离体切片制备方法，监测视锥感光细胞轴突末梢中 Ca2+ 动态的实验方案。该方案可在小鼠这一重要的哺乳动物模型系统中，对视锥细胞的 Ca2+...

成像小鼠视网膜视锥光感受器轴突末梢中的 Ca2+ 动态变化

我们建立了一种成年哺乳动物视网膜的水平切片制备方法，其切片平面与视网膜表面平行。非放射状取向的视网膜神经元树突野未被截断，从而可利用膜片钳和成像技术研究信号处理过程。...

成年小鼠视网膜水平切片用于电生理研究的制备

成像视网膜组织可提供传统生化方法无法获取的单细胞信息。本方案描述了用于共聚焦成像的斑马鱼视网膜切片制备方法。利用荧光遗传编码传感器或指示染料，可在不同类型的视网膜细胞中可视化多种生物学过程。...

制备成年斑马鱼新鲜视网膜切片用于 离体 成像实验

本研究介绍了一种替代性的视网膜平铺制备方法，通过去除感光细胞胞体，可加快抗体扩散速度，并改善对内层视网膜神经元进行免疫组织化学染色时的膜片钳电极接触条件。 原位 杂交和电生理实验。...

改良的视网膜劈裂铺片技术用于研究脊椎动物视网膜内核层神经元

视网膜在其层状结构中表现出复杂的空间组织。现代空间转录组学和测序技术需要厚度小于&lt; 20 µm的组织切片，这限制了其在视网膜研究中的应用。本新鲜冷冻冷冻切片方法可在保持视网膜平面空间关系的同时，制备小鼠视网膜的薄层en...

En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

学习一种新型视网膜水平切片制备方法，用于保护神经元树突形态并改善视网膜回路功能研究。该技术为神经科学和视觉处理机制研究提供了可靠的替代方案。

视网膜水平切片制备

探索更多视频