利用环境转录组学分析海洋微生物群落的基因表达

该实验流程首先通过使用五微米和三微米滤膜进行预过滤，从水样中获取海洋微生物生物量，随后在0.22微米滤膜上收集微生物。然后从截留在0.22微米滤膜上的生物体中提取总RNA。通过选择性酶降解去除核糖体RNA后，利用减法杂交富集Mr.N，并通过polyA加尾和体外转录进行线性扩增。

随后，使用随机六聚体将扩增的反义RNA转化为双链cDNA。所得到的cDNA可进行克隆和测序，或直接进行焦磷酸测序。大家好，我是来自佐治亚大学海洋科学系Marianne Moran博士实验室的Rachel Persky。

今天我们将向您展示一种从环境样本中分析基因表达的方法，该方法采用环境宏转录组学技术。Scott Gifford 将向您演示如何处理环境样本以收集 RNA。

我将向您展示如何从样本和 Johanna RINs 中提取 RNA。AON 将演示 RNA 去除步骤。随后，Maria Kosta 将讲解 RNA 扩增和 cDNA 合成的步骤。

接下来我们开始。为了启动环境RNA采集，我们通过将管路的一端放入采样所需深度的水中，并将另一端连接到一个高流量的3微米滤器，同时将泵置于管路的两个端点之间，从而建立过滤系统。然后将3微米滤器连接至0.22微米滤器塔，滤液从0.22微米滤器塔流出后导入一个带刻度的容器中。

通过系统运行数升水进行冲洗。操作完成后，在泵运行的同时将管路从水中取出，以排空管路中残留的水分。接下来，使用一对镊子将一个0.22微米滤膜放置在滤器塔上，并将其闭合。

将管路末端放回水中并启动泵。让空气从两个滤器中排出，同时通过大容量试剂瓶监测过滤的水量。当达到所需过滤体积后，将管路从水中取出，并排出系统中剩余的水。

滤膜干燥后，立即取下上层滤板并折叠滤纸。将滤膜放入离心管中，用液氮速冻。在开始实验之前，需要注意的是，由于RNA普遍存在且mRNA降解迅速，因此必须遵循无RNase环境操作的标准预防措施，包括工作台面和移液器的处理。

基于此，在操作本实验所用任何材料时，均应佩戴洁净手套。样品应尽可能在最短时间内完成处理。为开始从0.22微米滤膜中提取总RNA，我们通过向50毫升锥形管中加入8毫升含β-巯基乙醇的RLT缓冲液来制备珠磨管。

然后加入一到两毫升来自移动式土壤RNA提取试剂盒的RNA磁珠。迅速将冷冻的滤膜从冰箱中取出，并保持其处于冰袋中。用锤子将其敲碎。

将破碎的滤膜加入预先准备好的50毫升锥形管中，用封口膜或实验室胶带密封管盖，涡旋振荡10分钟。然后在室温下以5,000 RPM离心1分钟。尽可能吸出裂解液，并将其转移至15毫升离心管中，再次离心5分钟。

在5,000 × g条件下离心后，将上清液转移至新的50毫升离心管中，并向裂解液中加入等体积的100%乙醇。使用10毫升注射器，通过18至21号针头将裂解液缓慢吸入并推出，重复约五次。后续提取步骤请按照KaiGen R和easy mini试剂盒的说明书进行操作，使用真空 manifold 或反复离心的方式，将裂解液上样至提供的层析柱中。

通过分光光度法对总RNA进行定量。在确定总RNA产量后，我们根据制造商的说明，使用Ambien turbo DNA-free试剂盒去除任何DNA污染。现在RNA提取已完成，我将把总RNA交给Johanna，由她进行第一轮和第二轮rRNA去除步骤。

谢谢 Rachel。开始核糖体 RNA 去除步骤前，轻轻混匀并短暂离心 mRNA 仅含 10 倍反应缓冲液，在使用前将其转移至无菌无 RNA 酶的 0.5 毫升离心管中，加入适当体积的 10 倍反应缓冲液、RNA 抑制剂、总 RNA 样品和终止子外切酶。根据 Epicenter 说明书，将反应体系在 30 °C 条件下孵育 60 分钟，可使用带加热盖的 PCR 仪或水浴锅。

接下来，通过苯酚-乙醇沉淀终止反应。首先将无RNA酶的水加入至总体积为200 µL，然后向mRNA离心管中加入等体积的1:1苯酚-氯仿溶液。收集水相，随后用100%乙醇沉淀并离心。此处可作为潜在的暂停点。

RNA 可在负80摄氏度下保存，直至准备将样品用于下游应用。完成首次 mRNA 富集后，我们将根据生产商说明书，使用 Ambien 微生物富集和微生物表达试剂盒，去除样品中残留的 rRNA。为便于去除真核生物 rRNA，我们将使用微生物富集试剂盒。

所有体积均根据制造商说明书确定。开始移液时，将300 µL结合缓冲液加入1.5 mL离心管中。加入总量为5至100 µg的总RNA，最大体积为30 µL，然后涡旋混匀。

在结合缓冲液中，轻轻加入用于五微克 RNA 的两微升捕获寡核苷酸混合物，并轻轻弹动离心管。短暂离心使混合物沉至管底。先在 70 摄氏度下变性 10 分钟，然后在 37 摄氏度下孵育一小时。

孵育期间，通过将寡核苷酸磁珠用无核酸酶水洗涤一次，再用结合缓冲液洗涤一次来制备磁珠，每次洗涤之间将磁珠置于磁力架上捕获。将磁珠保存在冰上，并使其升温至室温。使用前5分钟，将洗涤液在加热块中加热至37摄氏度。

将RNA捕获寡核苷酸混合物加入洗涤后的寡核苷酸磁珠中，轻轻混匀管内液体并离心。在37°C下短暂孵育15分钟。将管子置于磁力架上，静置约3分钟，然后吸除含有mRNA的上清液，并将其转移至冰上的收集管中。

接下来，向捕获的磁珠中加入100 µL预热的洗涤液。轻轻涡旋混匀磁珠，并收集上清液。将含有mRNA的上清液收集至冰上的收集管中。

在准备使用 ambi microbe express 试剂盒去除原核生物 rRNA 时，将收集管置于冰上，该试剂盒用于去除残留的原核生物 rRNA。使用生物分析仪（bioanalyzer）或 Experion 检测 rRNA 污染情况及 mRNA 质量。此步骤可作为潜在的暂停点。

RNA 可在负80摄氏度下保存。在去除 rRNA 后，我们将根据生产商说明书，使用 Ambien Message AMP two bacteria 试剂盒对 mRNA 进行扩增。现在我们已获得纯化的 mRNA 样本，接下来我将实验交由 Maria 负责，她将为您演示 mRNA 扩增和 cDNA 合成过程。

感谢您，Hannah。在开始 mRNA 扩增之前，请在线计算 Ambien Message AMP Two Bacteria Kit 预混液中各组分的体积。我们通过将最多 1000 纳克的总 RNA 加入无菌无 RNA 酶的微量离心管中，开始对模板 RNA 进行多聚腺苷酸化。在第一缓冲液中使用 6.5 微升样品，不加无 RNA 酶的水，以通过体外转录合成 RNA。

建议使用杂交炉或培养箱，因为其温度均匀。由于防止管内形成冷凝水极为重要，我们强烈推荐进行14小时的体外转录反应孵育。为了获得最高产量的A RNA，应将IBT反应的终体积设为40微升，以最大化RNA产量，并将A RNA以约10微升的分装量储存于负80摄氏度。

RNA扩增完成后，即可开始合成互补DNA（cDNA）。采用Promega公司的Universal RiboClone™ cDNA合成系统试剂盒，由mRNA合成cDNA。该试剂盒提供的说明适用于将2微克mRNA转化为cDNA。我们建议投入6至10微克mRNA，并相应地按比例放大反应体系。

使用乙醇沉淀法或Promega Wizard DNA纯化系统清洁CD NA。根据制造商说明书，将样品在负80摄氏度保存。此时，可直接对双链CDNA进行测序。从10升海水中，我们提取了约10微克环境RNA，并通过将扩增的MR.NA转化为双链CDNA，实现了20倍的扩增，从而获得足够量的材料用于环境转录本的测序与分析。我们刚刚向您展示了如何利用环境宏转录组学技术评估海洋微生物群落中的基因表达。

请始终牢记，在进行此操作时，mRNA 会迅速降解，且 RNA 广泛存在。因此，必须采取标准预防措施，在无核糖核酸酶的环境中操作，并尽快处理样品。以上即为全部注意事项。

感谢观看，祝您的实验顺利。