Name: 社区环境转录从海洋微生物基因表达分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: 了解海洋微生物群落转录组分析方法，通过过滤采集生物量、提取总RNA、去除rRNA并扩增mRNA，最终合成cDNA用于测序。该方法为环境微生物学研究提供可靠工具。

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资金由戈登与贝蒂·摩尔基金会资助项目以及美国国家科学基金会资助项目 MCB-0702125 提供。

<ol><li>Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).</li>
<li>Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).</li>
<li>Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).</li>
<li>Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).</li>
<li>Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).</li>
<li>Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).</li>
</ol>

近年来，研究自然微生物群落的基因表达已成为探索微生物生态功能和作用的常用手段。将基因表达分析与海洋微生物的检测、定量和表征相结合，可将系统发育与自然微生物群落的功能联系起来。许多针对功能基因表达的技术依赖于针对已知序列基因设计的特异性探针或引物组。相比之下，环境转录组学能够在不受现有序列数据限制的情况下研究基因表达，并优先关注那些正在活跃表达的基因。因此，对环境中mRNA群体的分析可能是揭示关键生物活动与其介导生物之间关联的最有效方法之一。
环境转录组学的最初应用首次揭示了自然生态系统中细菌mRNA库的组成和动态变化3。对来自沿海盐沼（佐治亚州萨佩洛岛）和碱性高盐湖泊（加利福尼亚州莫诺湖）转录文库中表达基因的分析，揭示了具有生物地球化学意义的基因序列，包括几类功能基因（如几丁质酶基因和硫氧化基因）在这些生态系统中的环境变异型。该研究还提供了证据，表明存在此前未知且出乎意料的微生物过程，例如微生物降解维管植物和藻类来源的多胺，可能作为碳源和氮源。
随着分子技术的发展，环境样品中RNA操作的局限性逐渐减少...

<table><tbody><tr><td>PowerSoil 珠管</td><td>试剂盒</td><td>MoBio</td><td>12866-25-PBT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>mRNA-ONLY 原核生物 mRNA 分离试剂盒</td><td>试剂盒</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MOP51010/MOP51024</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Express&lt;/em&gt; 细菌 mRNA 富集试剂盒</td><td>试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Enrich&lt;/em&gt; 试剂盒</td><td>试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1901</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II-细菌 RNA 扩增试剂盒</td><td>试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1790</td><td></td></tr><tr><td>通用 RiboClone cDNA 合成系统</td><td>试剂盒</td><td>Promega Corp.</td><td>C4360</td><td></td></tr><tr><td>Wizard DNA 纯化系统</td><td>试剂盒</td><td>Promega Corp.</td><td>A7280</td><td></td></tr></tbody></table>

利用环境转录组学分析海洋微生物群落的基因表达

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

与宏基因组学类似，环境转录组学（宏转录组学）能够从微生物群落中获取并测序环境mRNA，而无需预先了解该群落可能表达哪些基因。因此，它为群落基因表达提供了最为无偏的视角in situ. 环境转录组学实验方案在技术上较为困难，因为原核生物的mRNA通常缺乏多聚(A)尾，而多聚(A)尾的存在使得真核生物mRNA的分离相对简单1由于mRNA的半衰期相对较短2此外，mRNAs 在总 RNA 提取物中的丰度远低于 rRNAs，因此 rRNA 背景信号常常掩盖 mRNA 信号。然而，近年来已开发出一些克服上述部分困难的技术。最近报道了一种通过使用随机引物逆转录并扩增环境 mRNA 以构建克隆文库来分析环境转录组的方法，该方法在两种不同的自然环境中均取得了成功，但结果受到用于启动 cDNA 合成的随机引物选择的偏倚影响。3. mRNA线性扩增技术的进步消除了扩增步骤中对随机引物的需求，使得起始材料用量更少成为可能，从而缩短样本的采集和处理时间，进而最大限度地减少RNA降解4.体外用于扩增 mRNA 的转录方法包括对 mRNA 进行多聚腺苷酸化，并在转录本的 3′ 端引入 T7 启动子。随后，扩增的 RNA（aRNA）可利用随机六聚体引物转化为双链 cDNA，并通过焦磷酸测序直接进行测序。5. 在ALOHA站首次使用该方法展示了其在表征微生物群落基因表达方面的实用性6.

我们介绍一种从环境mRNA生成cDNA的方法。通常，首先从环境中收集总RNA，选择性去除rRNA，选择性扩增mRNA，然后从富集的mRNA群体合成cDNA并进行测序。回收的序列可通过标准的生物信息学技术进行注释，以鉴定表达的基因。

类似于宏基因组学，环境转录组学（宏转录组学）从微生物群落中获取并测序环境mRNA……

该实验流程首先通过使用五微米和三微米滤膜进行预过滤，从水样中获取海洋微生物生物量，随后在0.22微米滤膜上收集微生物。然后从截留在0.22微米滤膜上的生物体中提取总RNA。通过选择性酶降解去除核糖体RNA后，利用减法杂交富集Mr.N，并通过polyA加尾和体外转录进行线性扩增。随后，使用随机六聚体将扩增的反义RNA转化为双链cDNA。所得到的cDNA可进行克隆和测序，或直接进行焦磷酸测序。大家好，我是来自佐治亚大学海洋科学系Marianne Moran博士实验室的Rachel Persky。今天我们将向您展示一种从环境样本中分析基因表达的方法，该方法采用环境宏转录组学技术。Scott Gifford 将向您演示如何处理环境样本以收集 RNA。我将向您展示如何从样本和 Johanna RINs 中提取 RNA。AON 将演示 RNA 去除步骤。随后，Maria Kosta 将讲解 RNA 扩增和 cDNA 合成的步骤。接下来我们开始。为了启动环境RNA采集，我们通过将管路的一端放入采样所需深度的水中，并将另一端连接到一个高流量的3微米滤器，同时将泵置于管路的两个端点之间，从而建立过滤系统。然后将3微米滤器连接至0.22微米滤器塔，滤液从0.22微米滤器塔流出后导入一个带刻度的容器中。通过系统运行数升水进行冲洗。操作完成后，在泵运行的同时将管路从水中取出，以排空管路中残留的水分。接下来，使用一对镊子将一个0.22微米滤膜放置在滤器塔上，并将其闭合。将管路末端放回水中并启动泵。让空气从两个滤器中排出，同时通过大容量试剂瓶监测过滤的水量。当达到所需过滤体积后，将管路从水中取出，并排出系统中剩余的水。滤膜干燥后，立即取下上层滤板并折叠滤纸。将滤膜放入离心管中，用液氮速冻。在开始实验之前，需要注意的是，由于RNA普遍存在且mRNA降解迅速，因此必须遵循无RNase环境操作的标准预防措施，包括工作台面和移液器的处理。基于此，在操作本实验所用任何材料时，均应佩戴洁净手套。样品应尽可能在最短时间内完成处理。为开始从0.22微米滤膜中提取总RNA，我们通过向50毫升锥形管中加入8毫升含β-巯基乙醇的RLT缓冲液来制备珠磨管。然后加入一到两毫升来自移动式土壤RNA提取试剂盒的RNA磁珠。迅速将冷冻的滤膜从冰箱中取出，并保持其处于冰袋中。用锤子将其敲碎。将破碎的滤膜加入预先准备好的50毫升锥形管中，用封口膜或实验室胶带密封管盖，涡旋振荡10分钟。然后在室温下以5,000 RPM离心1分钟。尽可能吸出裂解液，并将其转移至15毫升离心管中，再次离心5分钟。在5,000 × g条件下离心后，将上清液转移至新的50毫升离心管中，并向裂解液中加入等体积的100%乙醇。使用10毫升注射器，通过18至21号针头将裂解液缓慢吸入并推出，重复约五次。后续提取步骤请按照KaiGen R和easy mi

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Biology

生物学

社区环境转录从海洋微生物基因表达分析

使用微阵列进行细菌基因表达分析

本文描述了利用从季节性缺氧峡湾垂直深度连续样品中分离的环境基因组DNA构建fosmid文库的方法。通过自动化菌落挑取系统，将构建的克隆文库挑取至384孔板中，以便后续测序和功能筛选，并进行存档保存。...

大型插入片段环境基因组文库构建

本文介绍了一种从浮游微生物群落中提取代谢物的方法。通过将样品过滤至特制的滤膜上，实现整个群落的采样。经过冻干处理后，提取水溶性代谢物。该方法可将环境代谢组学应用于自然或实验性微生物群落的跨组学研究。...

利用核磁共振波谱法对低密度浮游群落环境代谢组学样品中代谢物的浓缩方法

表征微生物群落一直是环境微生物学中的长期目标。新一代测序技术如今能够以极低的成本和工作量，以前所未有的深度对微生物群落进行表征。本文详细介绍了我们使用台式测序仪对细菌16S核糖体RNA基因进行测序的方法。...

16S核糖体RNA基因扩增子的高通量测序

本文介绍了一种全面的实验方案，用于评估偏远海洋环境中有机和无机营养物质的可利用性，以及微生物和病毒群落的丰度与结构。...

揭开海洋中看不见的参与者——水化学与海洋微生物学野外指南

本文描述了利用DNA微阵列提供的尖端技术。微阵列可提供细菌在特定条件下所发生的转录组变化的全面概览。此外，我们还强调了通过使用便捷的自主开发软件包，能够轻松分析大量数据的优势。...

一种快速可靠的细菌转录组分析流程 
案例研究：丝氨酸依赖性基因调控 肺炎链球菌

本方案用于从海水中收集的微生物生物量中提取和浓缩蛋白质及DNA，随后生成适用于基于串联质谱的蛋白质组学分析的胰蛋白酶肽段。...

一种水生微生物宏蛋白质组学工作流程：从细胞到适用于串联质谱分析的胰蛋白酶肽段

我们开发了一种快速、灵敏且可重复的病原体基因表达谱分析方案，用于感染过程中的基因表达研究。...

利用数字条形码平台对感染微生物进行基因表达谱分析

本文提供了一种通过实时PCR定量沿海沉积物中细菌16S rRNA基因及其转录本的实验方案。该方法包括DNA和RNA的共提取、无DNA污染的RNA制备，以及通过反转录定量PCR（RT-q-PCR）对16S...

从沿海沉积物中同步提取DNA和RNA以及通过实时PCR定量16S rRNA基因与转录本

本文介绍了一种通过分析水体和沉积物中的微生物群落来研究水力压裂对附近溪流影响的实验方案。...

利用微生物分子特征评估水力压裂对溪流的影响

该方案可检测美国南部德克萨斯州沿海湿地中与甲烷循环相关的关键基因，并可视化其空间分布，从而加深对这些动态生态系统中甲烷调控机制及其环境影响的理解。...

可视化滨海湿地中甲烷循环微生物的动态变化

了解海洋微生物群落转录组分析方法，通过过滤采集生物量、提取总RNA、去除rRNA并扩增mRNA，最终合成cDNA用于测序。该方法为环境微生物学研究提供可靠工具。

利用环境转录组学分析海洋微生物群落的基因表达

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