社区环境转录从海洋微生物基因表达分析
February 18th, 2009
我们提出了一个方法生成环境的mRNA的cDNA。在一般情况下，总RNA是第一次从环境中收集，rRNA的选择性去除，mRNA的选择性扩增，并从丰富的mRNA池合成cDNA测序。使用标准的生物信息学技术确定基因表达，恢复序列，可以注明。
该程序首先通过 5 微米和 3 微米过滤器进行预过滤，从水样中采集海洋微生物生物质，然后收集到 0.22 微米过滤器上。然后从保留在 0.22 μm 过滤器上的生物体中提取总 RNA。通过选择性酶降解从总 RNA 中去除我们的 RNA，并通过 polyA 拖尾和体外转录线性扩增富集的 Mr.N 的消减杂交。
然后使用随机六聚体将扩增的反义 RNA 转化为双链 CD NA。所得 CD NA 可以克隆和测序，也可以直接进行热解测序。大家好，我是来自佐治亚大学海洋科学系 Marianne Moran 博士实验室的 Rachel Persky。
今天，我们将向您展示一种从环境样本中观察基因表达的程序。使用环境元转录组学。Scott Gifford 将向您展示如何处理用于 RNA 采集的环境样品。
我将向您展示如何从样品和 Johanna RIN 中提取 RNA。AON 将演示 RNA 去除。然后，Maria Kosta 将完成 RNA 扩增和 CD NA 合成步骤。
那么让我们开始吧。为了开始环境 RNA 收集，我们将管道的一端放入所需深度的水中进行采样，并将另一端连接到大容量 3 微米过滤器上，将泵放置在管道的两端之间，从而设置过滤管路系统。然后将 3 微米过滤器连接到 0.22 微米的过滤塔，并从 0.22 微米的塔流出到刻度货物中。
将几升水流过系统进行冲洗。完成后，在泵运行时从水中取出管子，以清除管线中的剩余水。接下来，使用一对镊子将 0.22 微米的过滤器放在过滤塔上并关闭。
将鱼线的末端放回水中并打开泵。允许从两个过滤器中吹扫空气，并监测使用细口大瓶过滤的水量。过滤所需体积后，从中取出管线并从系统中去除剩余的水。
过滤器干燥后，迅速取下顶部滤板并折叠滤纸。将过滤器放入旋流袋中，并在液氮中快速冷冻。在我们开始实验之前，重要的是要注意，由于 RNA 无处不在并且 mRNA 降解迅速，因此必须遵循在无核糖核酸酶环境中工作的标准预防措施，包括工作台面和移液器。
考虑到这一点，在处理此程序中使用的任何材料时，应戴上干净的手套。样品应在尽可能短的时间内处理。为了开始从 0.22 微米过滤器中提取总 RNA，我们通过在 50 毫升锥形管中加入 8 毫升 RLT 缓冲液和 β meto 乙醇来制备珠串珠管。
然后加入来自移动式土壤提取试剂盒的 1 至 2 mL RNA 珠。快速从冰箱中取出冷冻过滤器并将其保存在世界包装中。用木槌敲碎它。
将破碎的过滤器添加到准备好的 50 ml 锥形管中，并用香水或实验室胶带涡旋密封管盖 10 分钟。然后以 5， 000 RPM 的速度离心 50 毫升试管 1 分钟。在室温下，尽可能多地去除裂解液并将其转移到 15 mL 试管中，然后再次离心 5 分钟。
然后以 5， 000 次 G 将上清液转移至新的 50 毫升试管中，并向裂解物中加入一体积的 100% 乙醇。使用 10 毫升注射器，通过 18 至 21 号针头向上吸出裂解物，然后将其传回约 5 次。后续提取步骤，按照制造商的说明使用 KaiGen R 和 easy 迷你试剂盒，使用真空装置或重复离心将裂解物涂到提供的色谱柱上。
用光度法定量总 RNA 光谱。在确定总 RNA 产量后，我们根据制造商的说明使用 Ambien turbo DNA free 试剂盒去除任何 DNA 污染。现在 RNA 提取已完成，我将把总 RNA 交给 Johanna，她将进行第一和第二 RRNA 去除步骤。
谢谢 Rachel。要开始去除 RRNA，请轻轻混合并短暂离心仅 10 倍反应缓冲液的 mRNA，然后用于不含 RNA 的无菌 0.5 毫升试管，混合适当体积的 10 倍反应缓冲液 RNA 抑制剂、总 RNA 样品和终止子核酸外切酶。根据震中方案，将反应物在 30 摄氏度下在带有加热盖或水浴的热循环仪中孵育 60 分钟。
接下来，用苯酚乙醇沉淀终止反应首先加入总体积为 200 μL 的不含 RNA 的水，然后向 mRNA 离心机中加入一体积的一比一苯酚氯仿溶液。收集水相，然后用 100% 乙醇沉淀并攻击。这是一个潜在的停止点。
RNA 可以储存在负 80 摄氏度下，直到准备好在下游应用中使用样品。一旦我们完成了第一次 mRNA 富集，我们将根据制造商的说明使用 Ambien 微生物富集和微生物表达试剂盒从我们的样本中去除任何残留的 RRNA。为了促进真核生物 RRNA 的去除，我们将使用微生物富集试剂盒。
所有体积均通过阅读制造商的说明来确定。首先移液，将 300 μL 结合缓冲液加入 1.5 mL试管中。加入 5 至 100 μg 总 RNA，最大体积为 30 μL，然后涡旋。
在结合缓冲液中轻轻加入 2 μL 捕获寡核苷酸混合物，用于 5 μg RNA，然后轻轻敲击试管。短暂地旋转混合物。将混合物在 70 摄氏度下变性 10 分钟，然后将混合物在 37 摄氏度下放置 1 小时。
在孵育过程中，通过在无核酸酶的水中洗涤一次，在结合缓冲液中洗涤一次来制备 oligo mag 微珠，并在两次洗涤之间将微珠捕获在磁力架上。将珠子存放在冰上并加热至室温。使用前 5 分钟，将洗涤液在加热块中加热至 37 摄氏度。
将 RNA 捕获寡核苷酸混合物添加到洗涤的寡核苷酸磁珠中，轻轻埋葬，混合试管并离心。将混合物在 37 摄氏度下短暂孵育 15 分钟。将试管放在磁力架中等待约三分钟，然后吸出含有 mRNA 的上清液，然后将其转移到冰上的收集管中。
接下来，向捕获的珠子中加入 100 微升预热的洗涤溶液。并轻轻涡旋捕获珠子并回收上清液傻瓜。该上清液在冰上的收集管中 Mr.NA。
将收集管放在冰上，同时准备使用 ambi microbe express 试剂盒去除原核 RRNA，我们将使用它来去除残留的原核 RRNA。使用生物分析仪或 Experion 检查 RRNA 污染和 MR。NA 质量。这是一个潜在的停止点。
RNA 可以在零下 80 摄氏度下储存。去除 RRNA 后，我们将根据制造商的说明使用 Ambien 消息 AMP 两种细菌试剂盒来扩增我们的 mRNA。现在我们已经有了纯 mRNA 样品，我将把实验交给 Maria，她将带您完成 mRNA 扩增和 CDNA 合成。
谢谢你，Hannah。在我们开始 mRNA 扩增之前，在线计算 Ambien 消息 AMP 两种细菌试剂盒预混液的每个组分的体积，我们通过将多达 1000 ng 的总 RNA 放入无菌无 RNA 微量离心管中来开始模板 RNA 的多聚腺苷酸化。在第一种缓冲液中使用 6.5 μL 样品，不使用不含 RNA 的水，通过体外转录合成 RNA。
建议使用杂交炉或培养箱，因为它们的温度均匀。由于管内不形成缩合非常重要，因此我们强烈建议进行 14 小时的体外转录反应孵育。为了最大限度地提高 RNA 产量以获得最高的 A RNA 产量，请在 40 微升的最终反应体积中进行 IBT，将 A RNA 储存在零下 80 摄氏度的季盐中，约为 10 微升。
一旦 RNA 被扩增，就该合成互补体或 CDNA 了。Promega 通用 ribot 克隆。CDNA 合成系统试剂盒用于从 a NA 合成 CD NA。该试剂盒提供了将 2 μg（1 个 NA 转换为 CD NA）的说明。我们建议 NA 起始量为 6 至 10 μg，并相应地缩放反应。
使用乙醇沉淀或 promega 向导 DNA 纯化系统清洁 CD NA。根据制造商的说明，将样品储存在零下 80 摄氏度的双链 CDNA 此时可以从 10 升海水中直接测序，我们提取了大约 10 微克的环境 RNA，并通过转化扩增的 MR 以 20 倍的速度扩增。NA 到双链 CDNA 生成了足够数量的材料，用于环境转录本的测序和分析。我们刚刚向您展示了如何使用环境宏转录组学评估海洋微生物群落的基因表达。
永远记住，在执行此程序时，mRNA 会迅速降解，并且 RNA 无处不在。因此，请采取标准预防措施，在无肋核的环境中工作，并尽快处理样品。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本研究提出了一种从环境mRNA生成cDNA的方法，重点关注海洋微生物生物量。该过程包括收集总RNA，选择性去除rRNA，扩增mRNA，以及合成用于测序的cDNA。
关键研究组成部分
科学领域
- 环境微生物学
- mRNA分析
- 生物信息学
背景
- 海洋微生物生物量对于理解环境过程至关重要。
- cDNA合成对于研究基因表达至关重要。
- 选择性扩增mRNA可提高测序数据的质量。
- 生物信息学技术用于基因注释。
研究目的
- 开发一种从环境样本中可靠生成cDNA的方法。
- 提高对海洋微生物基因表达的理解。
- 促进表达基因的测序和注释。
使用的方法
- 通过过滤获取海洋微生物生物量。
- 从保留的生物体中提取总RNA。
- 选择性酶解降解以去除rRNA。
- 通过polyA尾部和体外转录扩增mRNA。
主要结果
- 从富集的mRNA池中成功合成cDNA。
- 获得高质量的序列以供进一步分析。
- 使用生物信息学有效注释表达基因。
- 展示了研究海洋微生物群落的潜力。
结论
- 该方法为从环境mRNA合成cDNA提供了一种稳健的方法。
- 增强了对海洋生态系统中基因表达的理解。
- 为环境微生物学的未来研究提供了宝贵的工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Environmental transcriptomics enables unbiased profiling of gene expression in complex marine microbial communities, providing critical insight into ecosystem function and microbial dynamics. For biopharma R&D, these workflows support the discovery of novel genes, pathways, and potential bioactive targets from environmental sources. Integrating robust transcriptomic analysis at the early discovery stage enhances predictive confidence and informs portfolio decisions for natural product and microbiome-based innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of gene expression in native microbial consortia.
- Supports functional target validation by capturing active transcripts without prior gene knowledge.
- Facilitates biological de-risking by revealing real-time community responses to environmental stimuli.
- Improves predictive confidence for selecting candidate genes or pathways for downstream screening.
Screening & Assay Development
- Generates validated cDNA libraries for high-throughput screening of environmental gene products.
- Standardizes mRNA enrichment and amplification, ensuring reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable preparation of sequencing-ready material for platform-based discovery.
- Provides reliable input for functional assays targeting novel enzymes or metabolites.
Translational & Preclinical Research
- Aligns environmental gene expression data with translational biomarker discovery when relevant.
- Supports continuity from environmental sampling to preclinical validation of microbial-derived candidates.
- De-risks advancement by confirming activity and expression of targets in situ.
- Enables risk-adjusted decisions for progressing environmental leads into preclinical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This transcriptomics workflow bridges environmental sampling and molecular analysis, positioning it at the interface of early discovery and lead identification for biopharma pipelines.
- Discovery Biology: Provides unbiased gene expression profiles to clarify pathways and validate functional targets in environmental samples.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cDNA libraries suitable for downstream screening and functional assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of transcript abundance, supporting comparative analyses across conditions or time points.
- Translational Research: Offers continuity for advancing environmental gene candidates into preclinical evaluation when supported by expression data.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for environmental transcriptomics applicable to diverse sample types and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection from environmental sources.
- Operational Value: Standardizes RNA extraction, rRNA removal, and amplification for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient triage of environmental discovery programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of novel microbial-derived assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, enzymatic rRNA removal, and nucleic acid amplification.
- Demands access to filtration, extraction, and sequencing instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to minimize RNA degradation and contamination.
- May require adaptation for different environmental matrices or microbial community compositions.
- Sample processing speed and RNA stability are critical practical limitations highlighted in the protocol.
