Name: 归巢的骨髓造血细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学习骨髓造血细胞归巢实验方案，通过分离、染色和追踪技术比较不同遗传背景细胞的归巢效率。该方法有助于深入理解造血细胞在骨髓微环境中的迁移行为，为细胞移植治疗提供重要参考。

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本方案已在大卫·斯坎登博士的实验室中进行测试并优化。资助由丹娜—法伯癌症研究所/麻省总医院临床血液学与肿瘤学研究项目提供。

<ol>
<li> 我们首先开始归巢实验，提取用于实验的细胞。在本实验中，我们关注的是从野生型（WT）小鼠（如C57BL/6J）和溶血磷脂酸受体1（Lysophosphatidic Receptor 1, LPAR1）转基因敲除小鼠（KO）中提取的全骨髓细胞，其向受体动物长骨中微环境的归巢能力是否存在差异。</li>
<li>在开始实验前，我们将准备实验所需的材料。在我们实验室中，所有小鼠解剖操作均在层流组织培养罩内进行，尤其是当细胞将被移植至受体动物体内而非用于离体（ex-vivo）分析时。我们首先在罩内放置一张蓝色垫单。所需其他物品包括已高压灭菌的镊子和锐利剪刀、无菌一次性手术刀片、酒精棉片、改良PBS溶液、无菌6孔板、研钵、研杵、50 mL蓝色盖锥形管以及70 μm一次性滤器。</li>
<li>我们首先取一只野生型（WT）和一只敲除型（KO）小鼠。</li>
<li>通过CO2吸入法处死小鼠，随后将其浸入70%异丙醇中5秒。此步骤可防止小鼠毛发污染目标细胞，在我们的操作中未发现对细胞得率或实验结果产生不利影响。</li>
<li>随后使用镊子和锐利剪刀依次解剖小鼠。通常我们按常规先处理野生型小鼠。在腹部腹侧皮肤做一小切口，用手将皮肤向两侧拉伸，即可轻松剥离后肢皮肤。接着小心取出股骨和胫骨，注意不要移除股骨头，因其含有大量骨髓。通过固定躯干并牵拉前肢，可将前肢整体取下，随后从中分离出肱骨。</li>
<li>取出的骨骼置于已加入改良PBS的6孔板中。改良PBS的配制方法为：在PBS中加入2 mL热灭活胎牛血清（FBS）和2 mL 0.5 M pH 8.0的EDTA溶液，经Nalgene 0.45 μm滤器过滤后，可在4°C保存至少一个月。</li>
<li>为准确区分野生型和敲除型骨骼，必须对孔板中的各孔进行标记。</li>
<li>将小鼠尸体移除并妥善处理。</li>
<li>在罩内更换新的垫单，使用一次性手术刀片清理骨骼。</li>
<li>将清理后的骨骼逐只放入研钵中，加入2 mL改良PBS，用研杵进行研磨。首先通过研杵前后移动10次左右将骨骼初步破碎，再通过旋转研磨进一步粉碎。我通常进行50次顺时针旋转，再进行50次逆时针旋转，如此反复，直至研钵中残留物呈白色，且加入的改良PBS保持白色或透明。</li>
<li>每完成50次旋转研磨后，将研钵中的液体转移至置于50 mL锥形管上的70 μm滤器中。每次转移后切记向研钵中补充2 mL PBS。切勿尝试研磨干燥骨骼或使其长时间处于干燥状态，以免导致细胞发生凋亡。</li>
<li>当研钵中物质变为白色后，将滤器中的残留物重新转移回研钵中再次研磨。此操作可确保滤器中残留的细胞不被浪费。通常再进行一至两轮旋转研磨后，研钵中物质再次变为白色，此时细胞提取完成。</li>
<li>将锥形管中的溶液进行离心（请注意将野生型和敲除型小鼠的细胞分别处理，因此将得到两个不同的离心管，分别含有WT和KO细胞），以1200 rpm离心10分钟。</li>
<li>使用不同的移液器分别吸除各管上清液。向每管沉淀中加入2 mL ACK裂解缓冲液（该裂解缓冲液应为无菌状态），冰上孵育5分钟。</li>
<li>向每管中加入8 mL改良PBS。从每管中取10 μL样品，分别加入96孔板中的两个独立孔中。将离心管放入离心机，以1200 rpm离心10分钟。</li>
<li>在离心过程中，向96孔板中含目标细胞的各孔加入30 μL台盼蓝染料和60 μL改良PBS。</li>
<li>取10 μL上述混合液（请通过反复吹打充分混匀），加入血细胞计数板，计数四个外侧大方格中的细胞数。</li>
<li>每毫升样品中的细胞数为所计细胞总数除以4，再乘以100,000。</li>
<li>离心完成后，从离心机中取出离心管，将细胞重悬于不含钙、镁和L-谷氨酰胺的PBS中，浓度为每毫升2000万个细胞。野生型和敲除型小鼠的细胞体积通常各约为5 mL。从本步骤起，实验流程中将使用普通PBS，而非改良PBS。</li>
<li>向每管中加入DiI（一种细胞染色染料），使其终浓度为5 μM。立即涡旋震荡10秒，37°C孵育10分钟，并避免光照。</li>
<li>用PBS充满各管，以1200 rpm离心10分钟。</li>
<li>离心后吸除上清液，将细胞重悬于PBS中，浓度为每毫升4000万个细胞。</li>
<li>将500 μL细胞悬液装入1 mL注射器（配备27G针头），每只野生型小鼠准备5支注射器，每只敲除型小鼠也准备5支。为稳妥起见，建议每组准备6支注射器，因接下来将进行的尾静脉注射操作具有一定难度，多备一支可提供备用。</li>
<li>用铝箔包裹注射器，以防止DiI降解。</li>
<li>向每只受体动物注射500 μL细胞悬液（每组5只动物）。</li>
<li>受体动物需在注射前4–24小时接受9 Gy辐照处理。</li>
<li>注射后48小时，从小鼠后肢采集骨髓。</li>
<li>按上述供体处理方法进行处理，将每只动物的细胞重悬于1 mL PBS中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
<li>使用BD公司的LSR II流式细胞仪或同等仪器进行检测。结果可表示为所分析骨髓中DiI阳性细胞的百分比或绝对数量。</li>
</ol>

<ol><li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li>
</ol>

归巢是指骨髓细胞（包括干细胞、祖细胞和分化细胞）在被注射到小鼠血液或骨髓腔后，迁移并进入骨髓的过程。从定义可以看出，科研人员可以选择研究通过免疫表型鉴定并经细胞分选分离的造血干细胞、祖细胞或分化细胞的归巢行为。通常，科研人员会注射经过谱系标记物耗竭处理的骨髓细胞，从而富集祖细胞和干细胞。
注射的目标细胞剂量是本实验中的一个变量。每只受体小鼠注射的细胞数量可在50万至2000万之间变化。注射的细胞数量越多，骨髓中的检测就越容易。然而，可获得的细胞数量可能会限制实际注射的细胞数。在大多数实验室现有技术条件下，分选2000万个LKS SLAM细胞极为困难，甚至可能不切实际，此时可选择使用上述范围中较低数量的细胞。
研究归巢现象时所使用的受体动物也可以有所不同。该受体动物可以是本实验中使用的经9 Gy辐射致死性照射的野生型C57BL/6J小鼠，也可以是未经照射的野生型C57BL/6J小鼠或W/Wv小鼠。是否对小鼠进行照射取决于实验者希望回答的科学问题。如果研究者希望在大量细胞因子释放和血管渗漏被诱导的条件下研究归巢现象，则选择经照射的...

<table><tbody><tr><td>DPBS（Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液）</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>无菌胎牛血清</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>BS3033</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA（pH 8.0）</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-150</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>盐酸普萘洛尔（Isopropranolol U.S.P.）</td><td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD 细胞标记溶液</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI 细胞标记溶液</td><td>Invitrogen</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

造血细胞向骨髓的归巢

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

归巢是指移植的造血细胞能够迁移至骨髓并植入或定植的现象。多种趋化因子及其受体参与了造血干细胞的归巢过程。[1, 2]
本文概述了造血干细胞研究中常用的经典归巢实验方案。该方案通常包括：分离需要研究其归巢能力的细胞群体，用特定荧光染料对该细胞群体进行标记，然后将标记后的细胞注入受体动物的血液循环中。在预定时间点处死受体动物，检测骨髓中携带该荧光染料标记的细胞所占的百分比或绝对数量。在一种最常见的实验设计中，会比较两个遗传背景不同的动物（野生型动物与其相应的基因敲除型动物）来源的造血细胞的归巢效率。本文将以此类实验为背景，详细描述造血细胞归巢的实验操作流程。

本文介绍了一种用于研究造血细胞归巢至骨髓微环境的实验方案。

归巢是指移植的造血细胞能够迁移至骨髓并植入或定植的现象。各种……

归巢是指移植的造血细胞迁移并定位于受体骨髓中的现象。本文介绍了一种研究造血细胞向骨髓特定区域归巢的实验方案。通过分离目标细胞群体，用染料对该细胞群体进行标记，然后将其注入受体动物的血液循环中。一段时间后测定动物体内染料阳性细胞的百分比。利用该方法，可比较来自两个遗传背景不同的动物的细胞归巢效率。大家好，我叫RHI Reen Yusef，是马萨诸塞州总医院再生医学中心和哈佛干细胞研究所David Skadden博士实验室的博士后研究员。今天我们将向您展示一种研究造血干细胞归巢至其正常定居部位——骨髓的实验方法。在我们的实验室中，利用该方案来研究不同基因修饰小鼠来源的造血干细胞在归巢能力上的差异。现在，让我们开始吧。开始归巢实验时，我们从野生型（WT）和溶血磷脂酸受体1（LPA R1）基因敲除动物中提取骨髓。所有小鼠解剖操作均应在层流组织培养罩内进行，特别是当细胞将被移植到受体动物体内时。进行解剖前，首先在罩内底部放置一层垫巾，然后将解剖工具置于垫巾上，包括经过高压灭菌的镊子和锋利的剪刀、无菌一次性手术刀以及酒精棉片。接下来，在生物安全柜中放置一瓶改良的PBSA、一个无菌的六孔板、研钵和研杵、一个50 mL蓝色盖子的锥形管以及一个一次性滤器。在通过CO2安乐死后，用70%异丙醇对小鼠尸体消毒5秒，以防止目标细胞受到污染。尽管小鼠体表有毛发，但此步骤似乎不会影响细胞得率或实验结果。对小鼠进行消毒后，使用一对镊子和锋利的剪刀在小鼠腹部腹侧皮肤上剪开一个小口。接着，用手将皮肤撕下，使皮肤脱离后肢。小心地轻松取出股骨和胫骨，以防止股骨头脱位，因为其中含有大量骨髓。接下来，在保持躯干不动的情况下，通过简单牵拉使上肢与动物躯干分离。将上肢作为一个整体移除。从这些上肢中取出肱骨眼。将收集到的骨组织置于六孔板中经改良的PBS溶液内，六孔板需标记为WT样本。对敲除小鼠重复此解剖操作，并将组织收集至六孔板中，此次六孔板需标记为敲除样本，并使用改良的 PBS。解剖完成后，妥善处理小鼠尸体，并在生物安全柜中更换新的防护衬垫。随后使用一次性手术刀清洁骨骼。将清洗后的骨骼逐只放入研钵中。今天从野生型（WT）样本开始。向研钵中加入 2 mL 改良 PBS，用研杵研磨骨骼。首先，通过将研杵来回移动10次来破碎骨骼。接着，使用环形旋转动作将骨骼研磨成粉末。您需要先顺时针旋转50次，然后逆时针旋转50次。完成第一组50次圆形研磨动作后，将研钵中的液体转移至置于50毫升锥形管上方的70微米滤膜上。切记向研钵中加入2毫升PBS。每次转移滤膜时都执行此操作，以防止骨组织干燥，从而避免细胞发生凋亡。当研钵中的材料变为白色后，将滤器中残留的材料重新转移回研钵，并再次开始研磨。这可以确保滤器中的细胞不会被浪费。重复进行一到两次环形研磨动作，直至研钵中的材料呈现白色，表明提取过程已完成。对 ka o 小鼠的样本

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生物学

归巢的骨髓造血细胞

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体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

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从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

学习骨髓造血细胞归巢实验方案，通过分离、染色和追踪技术比较不同遗传背景细胞的归巢效率。该方法有助于深入理解造血细胞在骨髓微环境中的迁移行为，为细胞移植治疗提供重要参考。

造血细胞向骨髓的归巢

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