显微注射mRNA和斑马鱼的胚胎吗啉反义寡核苷酸。

该程序首先制备 morpho 和体外转录的帽 mRNA。通过虹吸含有吗啡的溶液来填充微量移液器，然后使用千分尺校准注射体积一个细胞阶段。然后收集斑马鱼胚胎并安排在显微注射室中进行蛋黄显微注射。

将工作溶液注射到细胞正下方的卵黄中，并使用细胞质运动来携带用于细胞显微注射的溶液。注射后将溶液注射到细胞质中。将胚胎在 28.5 摄氏度下在 E 三种培养基中孵育，并在后续阶段对感兴趣的表型进行评分。

大家好，我是来自实验室的 Shiloh Yuen，Sasha 博士的儿子，耶鲁大学医学院遗传学系。今天，我们将展示一种强大的显微注射技术，用于在斑马鱼中进行 mRNA 过表达和形态寡核苷酸基因敲低研究。我们在实验室中利用该程序来研究纤毛 S 在囊性肾病中的作用。

那么让我们开始吧。基因功能研究的一种有效方法是在斑马鱼胚胎中显微注射体外转录的加帽 RNA。在本演示中，我们将显微注射 EGFP 标记的转录本，并使用活的全胚胎 GFP 表达作为成功注射的可见读数。

首先，我们将对您感兴趣的转录本进行体外帽 RNA 转录反应。在我们的实验室中，我们通常将感兴趣的 A-C-D-N-A 插入 PCs 二加载体中，并使用 M 消息 M 机器 SP six 试剂盒进行大量加帽 RNA 的体外合成反应。接下来，我们将通过 RN easy 迷你试剂盒或苯酚氯仿提取和异丙醇沉淀来纯化 RNA 样品。

仔细测定 RNA 制剂的浓度并将其储存在零下 80 摄氏度，直到注射当天准备好使用。轻轻解冻 RNA 样品涡旋并短暂旋转。现在用无菌水和终浓度为 0.025 至 0.05% 酚红的工作溶液，酚红用作将溶液注射到胚胎中的可见标记物。

在这里，我们将制备每微升 100 纳克 EGFP mRNA 和 0.05% 酚红的工作溶液。最后，将工作样品放在冰上，并将 RNA 原液放回零下 80 摄氏度。准备注射该样品时，继续制备 morpho。

Morino 反义寡核苷酸广泛用于通过阻断靶蛋白的翻译或修饰前体 NA 来修饰基因表达。斑马鱼的剪接形态通过敲除基因功能而成为一种强大的反向遗传学工具。在这里，我们将显微注射靶向 pkd 2 翻译起始位点的 morph oligo。我们通常使用 300 M 的 morph oligo，专为从 gene tools LLC 获得的目标基因而设计。

然后，我们加入 100 微升无菌水制成 3 毫摩尔的储备溶液，然后将溶液分装并储存在零下 20 摄氏度，直到注射当天准备好使用。我们将 morino 溶液在 65 摄氏度下加热 5 分钟。然后我们立即将溶液在冰上快速冷却并短暂旋转，此步骤使寡核苷酸中的任何二级结构变性，并确保溶液完全溶解。

接下来，我们将通过在无菌水中稀释 Morpho 溶液，最终浓度为 0.025 至 0.05% 松红来制备工作溶液。在本演示中，我们将制备 0.5 毫摩尔 PKD 二莫里诺和 0.05% 酚红的工作溶液。将工作溶液保持在室温下，并在准备注射该样品时继续进行微量移液器填充。

首先，我们需要制造用于注射的微量移液器。这是通过在微量移液器极性装置中加热和拉动 BOS 硅酸盐玻璃毛细管来完成的。拔出针头后，将它们保存在培养皿中，上面放上少量粘土或胶带。

接下来，我们将通过将 1.5%aros 倒入一个用楔形槽模制的 XE 三个中型板中来制备显微注射室板。这将作为在注射过程中保持胚胎的简单方法。然后让农用室板凝固并储存在 4 摄氏度，直到它们准备好使用。

开始填充微量移液器。用镊子或手术剃须刀片切开远端尖端，以创建一个在 50 倍放大镜下可见的开口。接下来放入 2 μL 的工作溶液。

将微量移液器的背面滴到盖玻片上，将微量移液器的背面连接到一个 5 毫升注射器上，该注射器在皮下注射针头上装有管道，然后将微量移液器的远端轻轻浸入您的工作液滴中。注意不要折断微量移液器的尖端。通过拉动注射器的柱塞，通过微量移液器的远端虹吸工作溶液。

接下来，我们将校准微量移液器注射体积。将一滴矿物油滴在千分尺载玻片上，然后打开压力脉冲微量注射器装置的电源和空气供应。接下来，将微量移液器连接到微量移液器装置的微量移液器支架上。

微型注射器是压力调节的，通过在解剖显微镜下踩下脚踏板来激活放电。使用微量注射器将一滴工作溶液滴在千分尺油上，以测试进样体积。测量液滴的直径，因为它像球体一样漂浮在油的顶部。

调整注射持续时间和压力，以仔细校准您的注射量。此步骤有助于显微注射实验的可重复性。在本演示中，所有微量注射都将以 0.15 毫米的液滴直径进行。

最后，校准进样体积后，使用微量进样器上的保持旋钮，以防止微量移液管回填和泄漏。现在是时候准备斑马鱼胚胎了。斑马鱼会在每天早上开始准备的最初几个小时内随机交配，收集 one 细胞阶段的胚胎并将它们放入 1 XE 3 培养基中。

使用 3 毫升移液管，将胚胎沿着显微注射室板中的楔形槽排列。去除培养基，使胚胎浅、浸没且不被淹没。此步骤有助于将胚胎沉降到槽的底部，以及微量移液器穿透果皮。

现在我们将开始注射。首先，我们将使用微量移液器作胚胎，以便在解剖显微镜下可以看到单细胞期胚胎的细胞质。注意不要折断微量移液器的尖端，用微量移液器穿透果核，然后穿透蛋黄，以便注射到胚胎中。

在本演示中，我们将首先将微注射到细胞正下方的蛋黄中，并让细胞质和扩散将工作溶液带入细胞。由于工作溶液中添加了酚红，因此这种流动是可见的。由于这是单细胞胚胎，因此可以徒手注射或使用机械手注射。

我们还将演示直接注射到细胞质中。直接显微注射到细胞中更稳健，但需要适当的胚胎定向和显微注射技术，因此非常耗时。由于细胞膜比卵黄膜更严格，因此通过蛋黄进入微量移液器到达细胞通常更快。

将动物极朝向槽底部并用稳定的手工作的细胞质可能有助于这种注射方法。显微注射后，将胚胎放入装有 E 3 培养基的培养皿中，并在 28.5 摄氏度下孵育以正常发育。在接下来的几个小时和几天的胚胎发育中，观察胚胎中您感兴趣的表型。

为了验证显微注射的成功，我们将通过体内全胚胎荧光显微镜监测 GFP 在盾牌阶段开始在发育中的胚胎中的表达 构建体的表达在胚胎发育的早期事件中最强，并且在发育过程中通常会减弱。由于注射的加帽 RNA 会逐渐降解，并取决于表达蛋白的稳定性。根据先前发表的结果，我们预计 PKD 二吗啡将模仿 PKD 二突变斑马鱼中的背轴曲率，并在受精后大约两到三天出现肾囊肿。

我们刚刚向您展示了一种强大的显微注射技术，用于在斑马鱼中进行 mRNA 过表达和形态寡核苷酸基因敲低研究，在进行此程序时，请记住这很重要。用稳定的手注射。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。