显微注射斑马鱼胚胎以分析基因功能

将雄性和雌性斑马鱼在繁殖笼中进行交配，受精卵会落入底部，便于收集。随后，将卵在培养皿中沿载玻片排列整齐。接着，剪断已装样注射针的尖端，并调整注射参数，使在显微测微尺下测得的注射液滴体积达到预期大小。

最后，将卵子逐个依次注射。大家好，我是来自波士顿儿童医院心脏病科John MA实验室的Jonathan Rosen。我是Michael Sweeney，同样来自VY实验室。

今天我们将演示如何将 mRNA 或吗啉代（morpholino）注射到斑马鱼胚胎中。在我们的实验室中，利用该方法研究特定基因产物敲低或过表达的影响。现在就开始吧。

首先，需在注射前一晚准备好鱼和繁殖用的水族箱，并安装隔板，以提高总产卵量。可根据需要按两条雌鱼配一条雄鱼的比例进行配对。第二天早上房间灯光开启后，从多个水族箱中移除隔板，让鱼自由交配约20分钟。使用滤网从繁殖笼中收集卵，并用卵水冲洗，然后倒入培养皿中。

使用鱼卵水，可将鱼类重新组合到更大的水族箱中，以产生更多用于注射的卵。调整采卵时间，以确保获得最大数量的卵，同时避免卵发育超过单细胞阶段。最后，将一块显微镜载玻片放入直径100毫米的培养皿倒置的盖子中。

使用移液管将卵沿载玻片一侧排成单列，然后用Kimwipe擦拭卵对侧的载玻片边缘，去除多余的卵液。接下来，我们将使用微电极拉制仪制备显微注射针。将外径为1毫米的玻璃毛细管拉制成两根针，并将其放置于150毫米的培养皿中。通过将针头架在橡皮泥制成的斜坡上，可预先拉制针头。

我们使用以下设置：加热 6，45 极，60 速度，80。使用微量移液器将三微升注射材料加载到针头的宽端。

将团块向针尖方向轻轻振荡，直至气泡所剩无几或完全消失。接下来，打开气源和微量注射器。将针头插入微量注射器中，并确保其在壳体内形成紧密密封。

检查显微操作仪是否处于合适位置，以确保具有足够的移动和调节范围。将针尖移至显微镜视野平面内，远离载物台，并聚焦于针尖最细的区域。

使用一对锋利的镊子在适当位置夹断针尖，使针尖足够细，能够刺穿卵黄膜和卵黄，同时仍能稳定地注入体积一致的液滴。为了计算每次注射的体积，可在千分尺上滴一滴矿物油，将针头插入油滴中，并踩下脚踏板，将一滴溶液注入油中。在修剪针头和调节注射压力时，需观察油中液滴的大小，以确保达到所需的注射体积。

直径为0.1毫米的微滴含有500皮升注射材料。通常使用的注射体积为500皮升或1纳升。理想的注射体积应约占卵子体积的10%。

针尖的质量对于注射操作的难易程度以及结果的质量和一致性都至关重要。现在开始进行注射操作。确保胚胎尚未发育超过四细胞阶段。

理想情况下，胚胎应处于单细胞阶段。接着，在观察下将针头缓缓移向卵柱，一次性平稳地刺穿卵膜表面并进入卵黄。若卵黄囊发生任何压碎或撕裂，应将注射物注入卵黄中。

避免注入气泡，并注意观察在连续注射过程中明显受损的胚胎。根据需要调整压力，以保持一致的液滴大小，并使用移液枪头移除未受精或在注射过程中被破坏的卵。完成一列卵的注射后，用轻柔的卵水水流将已注射的卵转移至干净的培养皿中，并根据需要重复操作。

保留若干未注射的胚胎作为对照。在注射后的第一天内，移除死亡的胚胎并记录注射胚胎的数量。定期更换培养皿中的养胚水，以降低感染风险。

需要注意的是，根据所注射物质的不同，胚胎的存活率可能低于未注射的同胞胚胎。幸运的是，可以轻松地注射大量胚胎，因此这通常不会成为问题。接下来，我们将展示一些形态注射和 mRNA 注射的代表性结果。

在受精后48小时，未注射的对照组胚胎表现正常，符合预期。然而，注射了能够抑制含有两个EEG类似重复序列中第一个重复序列的HG同源异构体的吗啡啉ol HG E三i三eeg FFR一的胚胎，则表现出脑水肿和心脏玻璃样变。在受精后24小时，Mr.NA也产生了明显的表型。

未注射的对照组胚胎头部外观正常。相反，部分注射了M NNA的胚胎表现出眼球畸形。我们刚刚向您展示了在单细胞阶段注射吗啉代寡核苷酸或mRNA，可以上调或下调特定基因在后续发育过程中的表达。进行该操作时，需要注意的是，同样重要的是。

mRNA或吗啉环（morpho）浓度过高均可能导致胚胎出现非特异性致死效应。每种试剂都需通过实验经验确定最佳浓度，但通常在200至500微摩尔（micromolar）范围内可特异性敲低基因活性，同时不会引起整体胚胎致死。情况就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。