Name: 人类胰岛的分离:第一部分:收集和胰腺组织消化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学习人类胰岛分离技术，了解如何通过自动化灌注方法消化和收集胰腺组织。本视频演示了获取高质量胰岛用于移植手术的标准操作流程，为移植生物学研究提供重要参考。

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由伊利诺伊大学芝加哥分校、胰岛细胞资源中心 NIH 基金（RFA-RR 05-003）、克里斯托弗基金会、埃夫罗姆森基金会和特拉布斯基金会资助。

1. 实验室设置
<ol>
<li>人胰岛分离是一项时间敏感的程序，需要团队合作，因此需要四人共同完成该操作。团队由外科医生领导，负责解剖并插管胰腺。</li>
<li>胰岛分离程序从团队进入UIC胰岛分离设施的那一刻即开始。团队成员需确保所有必要的仪器（如离心机）均已检查并开启，同时对所有生物安全柜及操作台面进行消毒。</li>
<li>两人负责准备插管操作台、冰沙机、消化回路、灌注装置、COBE纯化仪以及手术台。</li>
<li>与此同时，另外两名团队成员将配制分离过程中所需的各种培养基。</li>
<li>接下来，准备细菌培养管（瓶、管、表格和袋）、取样管（预装洗涤液）以及评估用试管和培养皿。</li>
<li>按以下方式准备纯化管组：第1根试管保持空置，并在150 ml处做标记；第2至第12根试管各加入200 ml添加人血清白蛋白的M199培养基（洗涤液），并在230 ml处做标记；最后准备一个50 ml锥形管，加入50 ml洗涤液。完成上述准备工作后，即可开始胰腺的准备与灌注操作。</li>
</ol>
2. 胰腺制备与灌注
<ol>
<li>开始胰腺的制备与灌注时，操作人员需采用无菌技术将器官从包装中取出。外科医生将胰腺转移至去污染台。</li>
<li>外科医生使用60 ml注射器抽取原始胰腺保存液，并交给操作人员，由其用于填充已准备好的“获取”用细菌培养瓶。</li>
<li>经肉眼检查评估器官是否适合进行胰岛分离（若胰腺在获取过程中受损或解剖结构异常，则不可用于胰岛分离）后，外科医生将要求操作人员准备胶原酶。请注意，不同品牌和批次的酶其重悬时间可能有所不同。</li>
<li>当外科医生准备就绪后，将去污染溶液（碘伏、制霉菌素/头孢唑林和HBSS）送至去污染台，并倒入相应的容器中。外科医生依次将胰腺在每种去污染溶液中洗涤约一分钟。随后将胰腺放入一个小的无菌广口瓶中称重。记录重量后，将胰腺置于含有保存液的插管盘中。</li>
<li>外科医生暴露主胰管并进行部分切开，使用套管对胰腺的两半分别进行插管，并用缝线固定套管。进行胰腺灌注时，先将胰腺转移至灌注装置，然后将酶溶液倒入灌注槽中。总灌注时间约为10分钟，前5分钟压力为80 mmHg，后5分钟为180 mmHg。灌注后胰腺明显膨胀。</li>
<li>将灌注完成的胰腺转移至插管盘，仔细修剪去除脂肪组织。随后将胰腺切成10–12块，并转移至Ricordi消化室进行消化。</li>
</ol>
3. 胰腺消化
<ol>
<li>开始消化步骤时，将胰腺转移至空的Ricordi消化室中，加入一支2.5 ml的Pulmozyme，将组织置于筛网上（避免大块组织堵塞消化室），关闭消化室，并灌注系统。</li>
<li>开始泵入溶液，持续5分钟。轻轻摇动孵育 chamber，使温热的溶液均匀分布。五分钟后，在整个消化阶段轻轻振荡 chamber。保持温度为37˚C。</li>
<li>轻轻摇动消化室直至温度达到37°，然后振荡消化室。每两分钟取样一次，镜下观察是否有游离的胰岛。将胰岛评估信息记录在批次记录的消化表格中。持续监测胰岛的游离百分比，直至溶液中游离且孤立的胰岛达到50%。</li>
</ol>
4. 组织采集
<ol>
<li>当样本中约有50%的胰岛已游离时，向循环系统中加入冷的RPMI稀释液以终止消化。将组织收集至预先加入30 ml人血清白蛋白的500 ml锥形管中。离心后吸除上清液，并用冷洗涤液清洗沉淀。在4˚C条件下，以1100 RPM（每分钟转数）离心1分钟。</li>
<li>将所有含有已消化胰腺组织的收集管合并至一个500 ml锥形管中。当某管中洗涤后的组织装满时，进行离心并重复洗涤过程，直至所有组织均被多次洗涤。将该管离心后，将组织转移至一个250 ml锥形管中，用添加了HA的M199洗涤液定容至250 ml，并准备取样。</li>
<li>用移液器取1 ml样品加入预先装有9 ml洗涤液的15 ml锥形管中。然后轻轻倒置15 ml锥形管混匀，从中直接取1 ml加入网格计数皿中。计数细胞，并使用2500（10×250）的稀释因子计算细胞数量。</li>
<li>将250 ml锥形管离心后，加入150 ml通常用于器官保存的UW（威斯康星大学）溶液。加入UW溶液后，用移液器充分混匀细胞悬液。记录并向纯化工序操作人员通报在UW溶液中的起始时间。将管子置于冰上并偶尔轻轻摇晃。此时可进一步纯化胰岛。</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

影响胰岛分离结果的因素多种多样9,10。其中，胰腺组织的消化过程起着关键作用。根据我们自身的人胰岛分离经验，总结了以下可能影响胰岛产量和质量的关键因素。
<ol>
<li>使用不同类型的酶时，消化时间有所不同。</li>
<li>一旦40-50%的胰岛完全从腺泡组织中分离，应立即加入稀释液并冷却组织，以终止消化过程。</li>
<li>在收集、洗涤和混匀组织时，操作应轻柔。</li>
<li>收集的组织与UW溶液的混合物应置于冰上至少30分钟，以获得更好的纯化效果。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>冰沙机</td><td>设备</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>制备无菌冰</td></tr><tr><td>离心机</td><td>设备</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 倒置显微镜 TLBD4.1</td><td>设备</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>带2 mm网格的细胞培养皿</td><td>设备</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>胰岛计数</td></tr><tr><td>EX7 数字水浴锅</td><td>设备</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>设备</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>MonoBloc 天平 AB 104-S</td><td>设备</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>测量胰腺重量</td></tr><tr><td>MasterFlex II 转速控制器</td><td>设备</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>调节消化过程中的流速</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>设备</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>灌注装置</td><td>设备</td><td>定制</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>灌注装置冷却器</td><td>设备</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Ricordi 室</td><td>设备</td><td>迈阿密大学</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 稀释液</td><td>试剂</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>威斯康星大学（UW）溶液</td><td>试剂</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 缓冲盐溶液（HBSS）</td><td>试剂</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>25% 人血白蛋白</td><td>试剂</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>M199 培养基（洗涤液）</td><td>试剂</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 NB1 GMP 级</td><td>试剂</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>中性蛋白酶 NB1 GMP 级</td><td>试剂</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>试剂</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>头孢唑林</td><td>试剂</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>二苯硫腙</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

人胰岛分离：第一部分：胰腺组织的消化与收集

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

1型糖尿病的管理对个人和社会而言都是一项沉重的负担，每年耗资超过1000亿美元。尽管血糖监测和新型胰岛素制剂已广泛应用，许多患者仍会出现严重的继发性并发症。胰岛移植能够恢复糖尿病患者的近似正常血糖控制1，且无须承担强化胰岛素治疗所伴随的严重低血糖发作风险。提供足够的胰岛组织量对于成功的胰岛移植至关重要。然而，供体特征、器官获取及保存过程均会影响胰岛分离的效果2. 在芝加哥伊利诺伊大学（UIC），我们开发了一种成功的分离方案，并优化了纯化梯度3该项目始于2004年1月，截至2008年11月已完成了300多次分离。胰腺组织以低温保存液（UW，威斯康星大学液或HTK，组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液）运送4-7送往伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）的细胞分离实验室进行胰岛分离。胰岛采用UIC方法进行分离，该方法是Ricordi最初描述的方法的改良版本。等 8. 简而言之，在清除胰腺周围组织后，使用酶溶液（Serva 胶原酶 + 中性蛋白酶或 Sigma V 酶）对胰腺进行灌注。膨胀的胰腺随后被转移至 Ricordi 消化室，连接至改良的封闭循环管路系统，并升温至 37°C。消化过程中，轻轻振荡消化室。持续取样以监测消化进程。一旦在显微镜下观察到游离胰岛，即通过向循环系统中灌注冷的（4°C）RPMI 稀释液（Mediatech，Herndon，VA）以稀释酶液，从而终止消化。组织经 M199 培养基（添加人血清白蛋白）收集并洗涤后，取样进行纯化前计数，并在纯化前与 UW 溶液共同孵育。纯化过程将在第二部分：人胰岛的纯化与培养中详细描述。

获得高质量且数量合适的胰岛是成功进行胰岛移植的重要前提之一。在本视频中，我们将逐步介绍采用改良自动化方法进行人胰腺胰岛分离的操作流程（第一部分：胰腺组织的消化与收集）。

1型糖尿病的管理对个人和社会而言都是一项沉重负担，每年耗资超过1000亿美元。尽管……被广泛使用，……

该操作首先获取正常的供体胰腺组织。经过短暂的修整步骤后，将膨胀的胰腺切成大小均匀的组织块，并转移至消化室中。通过自动灌注仪经导管向胰腺内灌注胶原酶溶液。最后，将胰腺组织收集到大容量的锥形管中，并进一步纯化以用于胰岛移植，相关内容将在后续视频中展示。大家好，我是来自伊利诺伊大学芝加哥分校调查系人类胰岛项目实验室的 American Chief。大家好，我叫 Barbara Barbero，我也隶属于人类胰岛项目。今天我们将向您展示一种人类胰岛分离的方法。我们在本机构使用该方法来获取高质量的人类胰岛，用于临床应用。现在开始吧。人胰岛分离是一项对时间敏感的程序，需要团队合作，因此需要四名人员共同完成。该团队由外科医生领导，负责解剖并插管胰腺。团队进入伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）胰岛分离实验室后立即开始胰岛分离操作。团队成员确保检查并开启所有必要的仪器设备，例如离心机。他们还需对所有生物安全柜及工作台面进行消毒。两人将负责准备插管操作台、冰浆机消化装置、循环灌注系统、单元净化机以及手术台。同时，另外两名团队成员将准备分离过程中所需的培养基。接着，准备细菌学试管、采样管以及用于评估的试管和平板。按如下方式准备纯化试管组：第一支试管为空，且在150毫升处做标记。第2至第12管中装有200毫升M1 99培养基，添加人血清白蛋白或洗涤液，并在230毫升处做标记。最后，另备一个50毫升锥形管，内装50毫升洗涤液。完成这些准备工作后，我们即可开始胰腺的制备与灌注。开始胰腺的制备与灌注时，操作人员将器官从包装中取出。外科医生采用无菌技术，将胰腺转移至去污染操作台。外科医生将用原始的胰腺保存液填充一支60 cc的注射器，并将其交给操作员，由操作员用其填充已准备好的器官获取用细菌培养瓶。在进行肉眼检查以确定器官是否适用于胰岛分离后，外科医生将要求操作员当天配制胶原酶。Prepare是一种choate。如果胰腺在获取过程中受损或存在解剖学异常，则不能用于胰岛分离。请注意，不同品牌和批次的酶，其 Resus 悬浮时间可能有所不同。当外科医生准备就绪后，将去污染溶液送至去污染台，并倒入相应的容器中。外科医生将通过用溶液清洗胰腺一分钟来对胰腺进行去污处理。随后，将胰腺放入一个小的无菌罐中，并在该罐中称重。重量录入批次记录后，将胰腺置于导管插入盘中。使用某些保存液时，外科医生将暴露主胰管并进行部分切开，然后用导管分别插管胰腺的两部分，并用缝线固定导管以灌注胰腺。首先，将其移至灌注装置，并将酶溶液倒入容器中。总灌注时间为约10分钟，其中在80毫米汞柱压力下灌注5分钟。然后在180毫米汞柱压力下灌注5分钟，胰腺将呈现肿胀状态。灌注完成后，将灌注过的胰腺转移至插管盘中，仔细修剪掉胰腺周围的脂肪组织。随后将胰腺切成10到12块，并转移至消化用记录室中进行消化。开始消化步骤时，将胰腺转移至空的记录室中。取一支1.25毫升的 Pulmozyme 小瓶，将其放在屏幕上方，注意避免遮挡记录室，然后关闭记录室并充满系统。开始泵入溶液，持续五分钟。轻轻摇动腔室，使温热溶液均匀分散。五分钟后，在整个消化阶段轻轻振荡腔室。保持温度为 37 °C。每两分钟取样一次，显微镜下观察是否有游离的眼状结构出现，并将眼状结构的评估信息记录在批记录的消化表格中。持续监测游离眼状结构的比例，直至溶液中游离且孤立的眼状结构达到50%。当样品中游离的眼状结构达到50%时，加入冷的RPMI稀释液终止消化。将环路组织收集到预先装有30毫升人血清白蛋白的500毫升锥形管中。在4摄氏度下，以1100转/分钟的速度离心锥形管1分钟。离心管离心后，吸除上清液并洗涤沉淀。使用冷洗涤液，将所有含有消化后胰腺组织的收集管合并至一个500毫升的锥形离心管中。当管中装满洗涤后的组织时，进行离心，并重复洗涤过程，直至所有组织被多次洗涤。将该离心管旋转后，把组织转移至一个250毫升的锥形管中。用添加了人血清白蛋白的M1 99洗涤液定容至250毫升，并准备取样。用移液器取1毫升样品，加入预先装有9毫升洗涤液的15毫升锥形管中。然后轻轻倒置15毫升锥形管以混匀。从该样品中直接取1毫升加入网格计数皿中。计数细胞并计算细胞数量。使用2倍稀释因子，将250毫升锥形管离心后加入150毫升威斯康星大学溶液（University of Wisconsin Solution）。加入UW溶液后，用移液管充分混匀细胞悬液，并记录相关信息后告知纯化操作人员。在uw中的起始时间。将离心管置于冰上，并偶尔轻轻涡旋。现在在此步骤中可进一步纯化小孔，同时取未纯化的胰腺组织样品进行计数。当将二酮溶液加入样本后，仅有胰岛细胞群会被染成红色，随后可对其质量和数量进行评估。我们刚刚展示了一种分离大量高质量人胰岛细胞的方法，这对于成功的胰岛移植至关重要。根据我们的经验，当约 40% 至 50% 的人眼小体从周围内层组织中游离出来时，我们应立即通过稀释并降低消化混合物的温度来终止消化过程。在组织收集、洗涤和混匀过程中，轻柔操作也至关重要。我们推荐使用 U University 的 Chicago 纯化方法，该方法可实现高纯度人眼小体的高效回收。该方法还显著缩短了分离时间，从而将最大限度地减少与缺血相关的眼片损伤。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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