监测植物在胁迫响应过程中的激素变化

该实验流程首先使用陶瓷珠对植物材料进行匀浆处理，随后采用二氯甲烷萃取以获得有机相。离心后，将样品在空气中干燥并准备进行气相萃取。经过气相萃取滤膜洗脱后，即可利用质谱法和气相色谱法进行植物激素分析。

大家好，我是来自德克萨斯大学圣安东尼奥分校生物系JU Engelberg实验室的Marie Engelberg，这位是Ju Engelberg。今天我们将向您展示一种同时定量多种重要植物激素的简单方法。我们常规使用该方法来监测这些激素在昆虫取食胁迫下植物体内的变化情况。

我们还可以监测脂肪酸组成的变化。现在开始操作。进行提取时，首先需要准备2毫升带螺帽的样品瓶。

为此，向一个样品瓶中加入 400 微升提取液和 10 微升浓度为每微升 10 纳克的相应内标物。接着，将样品瓶置于液氮中冷冻。冷冻后，向样品瓶中加入陶瓷珠。

在冻存管仍置于液氮中时，加入50至200毫克的植物材料。请注意，在后续处理前需预先估算所加植物材料的重量，以便后续基于鲜重进行准确定量。在用盖子 tightly 封闭冻存管之前，务必确保所有液氮均已蒸发完毕。

确保盖子带有橡胶密封圈，以防止在均质化过程中溶剂和提取物溢出。使用快速制备仪或PSUs珠磨机对组织进行均质化处理。使用均质器以6,000转速对PSUs处理30秒。

匀浆完成后，逐个从匀浆仪中取出离心管，小心打开管盖，向每个样品中加入1 mL二氯甲烷，再次 tightly 封紧管盖，于6,000转/分钟继续匀浆10至15秒。匀浆结束后，将离心管转移至台式离心机中，在10,000 × g条件下离心60秒，以分离有机相与水相。相分离完成后，将各离心管中的下层绿色液体转移至洁净的4 mL玻璃离心管中。

这是含有激素和内标物的有机相。避免转移水相或上层相，通过多通道吹扫装置用空气吹干溶剂，时间约为10至25分钟。具体时长取决于样品。

使用单个气流尖端仔细检查样品是否已干燥。务必注意不要过度干燥样品，因为这可能导致化合物损失。一旦样品干燥完毕，即可开始对样品中含羧酸的化合物进行甲基化处理。

首先，向每个小瓶中加入 100 µL 体积比为 9:1 的二乙醚-甲醇混合液。接着，加入 4 µL 浓度为 2 M 的三甲基甲基重氮甲烷己烷溶液。立即用带有聚四氟乙烯（Teflon）衬垫硅胶隔垫的开口螺口盖密封小瓶，轻轻振荡，并在室温下孵育 25 至 30 分钟。

打开加热模块，并将其设定至所需的收集温度。甲基化化合物的挥发性会因其分子大小和极性基团数量的不同而有所差异。在30分钟孵育后，向每个小瓶中加入4微升己烷中的2摩尔醋酸溶液，以终止甲基化反应，温度范围可在80至200摄氏度之间。

这是为了避免不必要的副反应。用于气相萃取的滤膜是手工制作的，由聚四氟乙烯管制成。

从一侧插入一根长约四厘米、贴合良好的玻璃管。可以看到两个不锈钢网片，其中含有约20至30毫克的吸附剂。使用200微升甲醇清洗将用于收集甲基化及挥发性植物激素的滤膜。

接下来，用 200 微升二氯甲烷将滤膜清洗两次。每次清洗后，将滤膜空气干燥以除去残留溶剂。现在，这些滤膜可用于通过气相萃取来捕获挥发性激素。

样品孵育30分钟后，用手术刀切开4毫升小瓶瓶盖上的橡胶垫。此时，提取物已准备好，可用于通过气相萃取法收集植物激素。将已清洗的滤膜连接至各自的真空管路，流速约为800毫升每分钟。

然后将滤膜通过切割后的隔垫插入小瓶中。同时插入一个小型移液器吸头作为进气口。在该操作的初始阶段，必须将装有滤膜的小瓶保持直立状态，以防止小瓶内的液体接触到滤膜尖端，否则会导致滤膜污染。

随后，用手握住GCMS小瓶，直至液体全部通过滤膜蒸发。然后将带有滤膜的小瓶置于加热块上，收集加热蒸发的化合物3分钟。完成此最终的气相萃取步骤后，将仍附有滤膜的小瓶放置于试管架上，使其冷却。

当滤膜达到室温后，准备装有内插管的1.5毫升气相色谱小瓶。再次用移液环向小瓶中加入150微升二氯甲烷。将滤膜上残留的溶剂吹干后，盖上瓶盖，即可进行气相色谱-质谱分析。

进行分析时，使用配备分流-不分流进样器的气相色谱仪，并与在化学电离模式下运行的质谱仪联用。进样后，化合物在 HP-1MS 柱上分离，初始温度为 40 °C，保持 1 分钟。程序升温条件为：以 15 °C/min 的速率升至 250 °C，保持 10 分钟，载气为氦气，恒定流速为 0.7 mL/min。在基于质谱的分析中，四极杆和离子阱质谱仪均可作为化学电离（CI）气源使用。

可使用异丁烷或甲醇。但在每种情况下，都应在创建选定离子计数程序之前检查电离反应的碎片。我们采用配备 Saturn MS 2200 质谱仪的 GC 3,900 型气相色谱系统，并以甲醇作为化学电离（CI）试剂。

有关我们实验方案的详细描述，请参见我们的书面协议。务必通过与真实可得的市售标准品进行比对，以确定所有化合物的身份。JA、SA和ABA的定量分析是通过将目标物提取离子的峰面积与其相应内标物提取离子的峰面积进行关联完成的，同时基于所用植物材料的鲜重进行计算。

在从 GCM S 文件中提取数据并进行一些计算后，我们发现与未经处理的对照组相比，乙烯诱导了水杨酸、茉莉酸以及脱落酸的显著积累。每种激素的数据均来自单次运行，展示了该方法在多重激素分析方面的潜力。我们刚刚向您展示了一种简便但高效的流程，用于提取和定量重要的植物激素及其他信号分子。

该操作简单易行，且您所看到的大多数工具均可使用标准实验室材料轻松制作。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。