Name: Channelrhodopsin2介导的突触电位刺激果蝇神经肌肉接头 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学习利用Channelrhodopsin2光遗传学技术在果蝇幼虫神经肌肉接头诱发突触电位的方法。该技术为神经突触生理学研究提供了一种简便、经济的替代方案，适用于教学与科研实验室。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目RO1GM-33205和MH-067284（授予L.C. Griffith）以及布兰迪斯大学本科生暑期科研奖学金（授予N. J. Hornstein）的支持。该技术的初步实验是在马萨诸塞州伍兹霍尔海洋生物实验室（Marine Biological Laboratory）进行的，作为2008年神经系统与行为暑期课程（NIMH资助项目：R25 MH059472）的一部分。

第一部分：动物护理与遗传杂交
<ol>
<li>维持 UAS-ChR2 和 OK371-GAL4 将果蝇品系分别饲养于含有标准果蝇培养基的独立培养瓶中 8.</li>
<li>收集处女蝇 OK371-GAL4 果蝇品系及UAS-ChR2品系的雄性个体。</li>
<li>将雄性和雌性果蝇放入含有标准果蝇培养基并添加1 mM 全反式视黄醛（ATR）的试剂管中。ATR食物的制备方法如下：首先将常规果蝇培养基放入微波炉中加热约1分钟，直至完全融化；待其冷却约30秒至1分钟后，加入ATR 100 μl 每10 ml果蝇培养基中加入100 mM ATR的100% ETOH溶液。将试管置于冰上，随后储存在黑暗处 4°C.</li>
<li>让果蝇在22-25°C的黑暗环境中交配并产卵25°C.</li>
<li>等待3-4天，直至观察到3龄幼虫；此时，处理掉成虫果蝇。</li>
</ol>
第二部分：设备设置
<ol>
<li>将任意10倍解剖镜目镜（本实验中使用卡尔蔡司公司，Carl Zeiss Inc.，www.zeiss.com，纽约州索恩伍德）连接至带散热片的蓝色LED光源（Thorlabs，www.thorlabs.com，新泽西州纽顿）。将其固定于带支柱和夹具的磁性底座上。用接地的金属屏蔽罩覆盖散热片，以减少光源产生的电噪声。</li>
<li>将带有光源的磁性底座放置在电生理装置的隔振台上。</li>
<li>将光源连接至控制电路，并将控制电路连接至外部电压源（Powerlab 4/30，ADInstruments，www.adinstruments.com，科罗拉多州科罗拉多斯普林斯）。</li>
<li>向控制电路施加1–5 V的脉冲以激活蓝光。</li>
<li>调节磁性底座和光源位置，直至蓝光光束聚焦于幼虫解剖操作区域。</li>
</ol>
第3部分：解剖
<ol>
<li>将六根0.1 mm的昆虫针插入硅胶衬里的培养皿底部。</li>
<li>从培养基中取出一只3rd 龄幼虫，并放入任意塑料培养皿中。</li>
<li>用生理盐水冲洗幼虫以去除食物残留。</li>
<li>将幼虫置于解剖皿中靠近拉制好的针附近，并加入生理盐水至皿高的1/2处。</li>
<li>调整幼虫方向，使其背侧表面可见两条银色管状结构（气管）沿身体纵轴延伸。</li>
<li>将一根大头针直接插入尾部两根气管之间的位置，固定住幼虫，再将第二根大头针插入其头部，确保将身体沿纵轴拉直。</li>
<li>在尾部附近做一小切口，并沿身体长度方向继续剪开。剪切时确保剪刀尖端略微上抬，以免意外剪断腹侧神经和/或体壁肌肉。</li>
<li>将四根针分别固定在动物打开后的中段四个角上，插入解剖皿中，以实现动物的剖开固定。确保组织被充分拉紧。</li>
<li>使用镊子和剪刀，小心移除动物的内脏、气管和脂肪体。</li>
<li>用生理盐水冲洗标本。</li>
<li>在标本上定位前脑叶（如图A所示）以及腹神经节。</li>
<li>使用显微剪刀，在前脑叶后方小心地剪断腹神经节。</li>
</ol>
第4部分：肌肉记录与蓝光刺激
<ol>
<li>使用电子电极拉制仪（Sutter Instruments）拉制一个 10–20 μΩ 的电极。</li>
<li>用 3 M KCl 溶液填充已拉制的电极。</li>
<li>将填充好的电极放入电极夹持器中，并在电生理装置的解剖显微镜下，使用显微操作器将电极尖端移至幼虫标本附近。</li>
<li>在任一躯体节段中识别第6号肌肉（M6）（图A）。</li>
<li>小心地将电极插入M6肌肉中，并观察是否出现快速的超极化现象。肌肉的静息膜电位通常在 -30 mV 至 -70 mV 之间。</li>
<li>调节蓝光位置，使解剖后的标本位于光束中心。</li>
<li>向控制电路施加 20–100 ms 的电压脉冲，并逐步增加供给控制电路的电压。观察肌细胞中是否出现兴奋性接头电位（图1B）。</li>
</ol>
代表性结果：
图1A展示了记录装置和去肌膜制备的示意图。图1B显示了短光脉冲诱发的典型兴奋性接头电位（EJP）。所示EJP幅度为已知均支配M6的两个运动神经元的总和幅度。较低的光强度仅激活一个运动单位（数据未显示）。
<img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="光遗传学实验示意图：神经刺激装置与电压响应图，40 ms 脉冲。" width="600" height="373" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1">
图1：A) 带有蓝色LED的细胞内记录装置通用示意图。移除脑（Br）以抑制腹神经节（VG）中的节律性活动。使用GAL4-UAS系统在运动神经元中表达ChR2。B) 来自M6肌肉的细胞内记录。40毫秒的蓝色光脉冲（光强为127 µW / mm2）可在M6中可靠地诱发大幅突触电位（星号标注）。

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

我们没有需要披露的利益冲突。

关键步骤包括最初的解剖操作以及进入肌细胞的过程。如果在初始解剖过程中神经被切断或肌肉受到损伤，则很难继续完成后续实验。在解剖过程中，进行背侧切口时必须尽可能将解剖剪向上倾斜，操作时需格外小心。在第二个关键步骤——进入肌细胞时，应观察是否出现超过约30 mV的超极化现象。若电位值高于-30 mV，则表明电极可能未正确进入肌细胞，或细胞处于不健康状态。

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>显微操作针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neuroprobe 细胞内放大器及探头</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;Powerlab 4/30 数据采集系统&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Grass 刺激器</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>台式计算机</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>光源</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>果蝇培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>全反式视黄醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;OK-371 Gal4&lt;/em&gt; 果蝇</td><td>Bloomington Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-ChR2&lt;/em&gt; 果蝇</td><td>Fiala 实验室，Griffith 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED 控制电路</td><td>Griffith 实验室自制</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;组成包括：&lt;br/&gt;1. 200 mA 降压恒流驱动器（Buck Puck）&lt;br/&gt;2. 蓝色 LED&lt;br/&gt;3. 绝缘导线&lt;br/&gt;4. 电路面包板&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>LED 散热片</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>气浮隔振台</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>Griffith 实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Leitz M 微操作器</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>电极夹持器</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃管</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>含 0.8 mM Ca²⁺ 的 HL 3.1 生理盐水</td><td></td><td></td><td>成分（mM）：&lt;br/&gt; NaCl:70 KCl:5 CaCl&lt;sub&gt;₂&lt;/sub&gt;: 0.8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;₂&lt;/sub&gt;:4 蔗糖:115&lt;br/&gt; NaHCO&lt;sub&gt;₃&lt;/sub&gt;: 10 海藻糖: 5 HEPES</td></tr><tr><td>显微解剖工具</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

光遗传刺激突触电位的通道视紫红质2介导方法 果蝇 神经肌肉接头

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

TheDrosophila幼虫神经肌肉制备已被证明是研究突触生理学的有用工具1,2,3目前，对此制备标本诱发兴奋性接头电位（EJPs）的唯一可用方法是使用吸吮电极。在科研和教学实验室中，学生常常难以操作和操控这类刺激电极。在本研究中，我们展示了如何在不使用吸吮电极的情况下，远距离刺激幼虫神经肌肉接头（NMJ）的突触电位。通过表达光敏通道蛋白2（ChR2）4,5,6在Drosophila使用运动神经元GAL4-UASsystem7，并对基础的电生理设备进行微小改造后，我们能够通过蓝光脉冲可靠地诱发出终板电位（EJPs）。该技术可能特别适用于神经生理学教学实验室，在此类实验室中，学生的设备操作时间和资源往往有限。

该实验利用蓝光激活的藻类通道蛋白和细胞特异性基因表达工具，在果蝇（Drosophila）幼虫的神经肌肉接头（NMJ）处通过光脉冲诱导突触电位。该技术为科研和教学实验室中的突触生理学研究提供了一种成本低廉且易于使用的替代方法，可取代传统的吸吮电极刺激。

果蝇幼虫神经肌肉标本已被证明是研究突触生理学的有用工具1,2,3。目前，唯一可用的方法……

该实验流程首先从培养果蝇开始。将具有适当基因型的三龄幼虫置于含有全反式视黄醇的食物中进行培养。每个幼虫均以头部和尾部固定。 然后将 FLA 平放。接着切断脑部和后部神经以终止节律性运动活动。随后，调节并聚焦带有控制盒的蓝色 LED 光源，使其照射在制备样本上。最后，使用锋利的电极刺入第六块肌肉，然后通过电压源传递光脉冲。大家好，我是来自布兰迪斯大学生物学系莱斯利·格里菲斯博士实验室的Nicholas Marstein。大家好，我是来自格里菲斯实验室的Stefan Pulver。今天我们将向您展示如何在黑腹果蝇幼虫的神经肌肉接头处利用channelrhodopsin-2（ChR2）诱导突触电位。我们实验室使用该方法研究果蝇的突触生理学。我们还利用它来向学生讲授突触生理学并开展教学实验课程。现在让我们开始吧。要启动本实验方案，需在分别装有标准果蝇培养基的培养瓶中，维持UAS channel redsin two和okay, 3 7, 1 gal four果蝇品系。从3至7日龄的四条果蝇品系中收集处女蝇，并从UAS channel redsin的两条品系中收集雄蝇。接下来，制备含有1毫摩尔全反式视黄醇（all trans retinol）或aTR的果蝇培养基。具体操作为：将常规果蝇培养基放入微波炉中加热约一分钟，使其融化。待培养基融化后，静置冷却约30至60秒，然后每10毫升果蝇培养基加入100微升溶于100%乙醇的100毫摩尔TR。当含有TR的培养基试管准备就绪后，将收集的雄性和雌性果蝇分别放入各试管中。将试管置于22至25摄氏度的避光环境中，使果蝇交配并产卵，等待四到五天，直至观察到三龄幼虫。此时，可以处理掉成年果蝇。现在我们已准备好进行电生理记录装置的搭建。将任意解剖显微镜目镜连接至带散热片的蓝色LED光源。使用支架和夹具将磁性底座固定到目镜和LED光源上。将磁性底座放置在电生理装置的气浮台上。接着，将光源连接至控制电路，然后将控制电路连接至外部电压源。我们使用由AD Instruments公司生产的Power Lab电生理数据采集系统的电压输出。连接电压源后，向控制电路施加1至5伏的脉冲，以激活蓝光；调整磁性底座和光源，直至蓝光光束聚焦于幼虫解剖区域。完成适当调整后，即可进行幼虫解剖操作。开始解剖时，将六根0.1毫米的细针插入盛有Sogar培养基的培养皿底部。从培养基中取出三龄幼虫，放入任意塑料培养皿中。用生理盐水冲洗幼虫，以去除附着在幼虫体表的培养基。然后将幼虫放置在解剖皿中靠近拉直的细针附近，并向皿中加入生理盐水至半满。调整幼虫的方向，使其背侧表面可见两条银色的管状结构，这些银色管状结构即为气管。将一根大头针直接插入气管束之间的尾部。固定住幼虫，并将第二根大头针插入其头部。插入大头针时，务必沿纵轴方向将身体拉直。使用剪刀在尾部附近做一个小切口。沿身体长度方向继续切开。注意将剪刀尖端略微抬起，以避免损伤腹侧神经和（或）体壁肌肉。在动物的四个角上放置四根大头针。现在打开中段。将大头针插入解剖皿中，以便对动物进行剖片处理。同时用镊子和剪刀固定标本，使其保持紧绷。移除动物的消化器官、气管和脂肪体。用生理盐水冲洗标本。清洗后，使用显微剪刀找到样本的额叶和腹神经节。在额叶后方小心剪断腹神经节。解剖完成后，进行蓝光刺激并记录肌肉反应。进行肌肉记录时，拉制一个电阻为10至20兆欧的电极。使用电子电极拉制仪，将拉制好的电极填充3摩尔的KCl溶液。将填充完毕的电极放入电极夹持器中。现在将幼虫标本置于解剖显微镜下的装置上。调节蓝光，使解剖后的标本位于光束中心。使用显微操作器，在幼虫任一体壁节段中识别第六肌或M六肌，小心地将电极插入M六肌，并观察是否出现快速超极化肌肉反应。静息膜电位应在负30毫伏至负70毫伏之间。电极正确插入后，向控制电路施加20至100毫秒的电压脉冲。逐步增加供给控制电路的电压。注意观察肌细胞中的兴奋性突触后电位。以下是一个代表性结果，显示了由短暂光脉冲诱发的兴奋性突触后电位。此处所示的兴奋性突触后电位幅度来自两个已知均能引发兴奋的运动神经元的总和幅度。六号肌。较低强度或较短时间的光照可暴露出单个运动神经元引发的微小幅度兴奋性突触后电位。我们刚刚向您展示了如何在果蝇神经肌肉接头处进行通道视紫红质-2介导的突触电位刺激。进行此操作时，重要的是要注意在解剖过程中不要损伤标本的体壁。还需要注意，尽管标本在解剖后可能暂时处于过度兴奋状态，但随着时间推移会逐渐平静下来，从而获得良好的记录结果。刺入肌肉时，应小心避免穿透第一层肌肉进入体壁深处。当电极插入体壁时，有时可能会记录到超极化电位，但实际上并未进入肌细胞。情况就是这样。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

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Biology

生物学

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