Channelrhodopsin2介导的突触电位刺激果蝇神经肌肉接头
2009年3月16日
此过程使用蓝色光激活藻通道和细胞特异性基因表达的工具，以唤起光脉冲在神经肌肉接头（NMJ）突触潜力果蝇幼虫。这种技术是一种廉价和易于使用替代吸电极刺激突触生理学研究，在研究和教学实验室。
这个过程从生长果蝇开始。第三，在含有所有反式视黄醇的食物上具有适当基因型的龄蛆。每只蛆虫的头和尾都被钉住了。
然后是 FLA flat。然后切断大脑和后神经以停止有节奏的运动活动。接下来，调整带有控制箱的蓝色 LED 光源并专注于准备工作。
最后，使用锋利的电极刺穿第六块肌肉。然后用电压源传递光脉冲。大家好，我是来自布兰代斯大学生物系 Leslie Griffith 博士实验室的 Nicholas Marstein。
大家好，我是 Stefan Pulver，同样来自格里菲斯实验室。今天，我们将向您展示在果蝇幼虫的神经肌肉接头处没有 2 通道根的情况下诱发突触电位的程序。我们在实验室中使用该程序来研究突触生理学和果蝇。
我们还用它来教授学生突触生理学和教学实验室。那么让我们开始吧。要开始使用此方案，请将 UAS 通道 redsin 2 和 okay、3 7、1 gal 4 飞线保持在包含标准飞蝇培养基的单独瓶子中。
从 UAS 频道 redsin 收集 3 7、1 加仑、四条飞线和雄性。两条线。接下来，制作与一毫摩尔、全反式视黄醇或 TR.To 混合的苍蝇培养基，在微波炉中融化普通苍蝇培养基约一分钟。
熔化后，让培养基冷却约 30 至 60 秒，然后为每 10 毫升苍蝇培养基添加 100 微升 100 毫摩尔/TR 的 100% 乙醇溶液。当含有 TR 培养基的小瓶准备好后，将收集的雄性和雌性放入每个小瓶中。将小瓶放在 22 至 25 摄氏度的黑暗区域，让苍蝇交配和产卵，等待 4 到 5 天，直到看到第三个星幼虫。
此时，您可以处理成蝇。我们现在已准备好继续设置电生理装置。将任何解剖镜目镜连接到带有散热器的蓝色 LED 光源。
使用柱子和夹子将磁性底座连接到目镜和 LED 光源。将磁性底座放在电生理装置的空气台上。接下来，将光源连接到控制电路，然后将控制电路连接到外部电压源。
我们使用 AD Instruments 制造的 Power Lab 电生理学数据采集系统的电压输出。连接到电压源后，向控制电路发出 1 到 5 伏特脉冲以激活蓝光，调整磁性底座和光源，直到蓝光聚焦在幼虫解剖要占据的区域。做出适当的调整后，我们准备继续进行幼虫解剖。
要开始解剖，请将六个 0.1 毫米的针放入衬有 sogar 的盘子的地板上。从食物培养基中取出三分之一的星形幼虫，并将其放入任何塑料培养皿中。用盐水冲洗幼虫，以去除附着在幼虫上的任何食物。
然后将幼虫放入靠近拉动的销钉的解剖皿中，并在培养皿中装满一半的盐水。现在确定幼虫的方向，以便您可以看到两个银色管子沿着动物的背面延伸。这些银色管是气管。
将一个大销头直接插入气管插管之间的尾部。按住幼虫，将第二个大针插入其头部。插入销钉时，请务必纵向拉伸主体。
用剪刀在尾巴附近做一个小切口。继续切口向上延伸到身体的长度。确保剪刀的尖端抬起，以免割伤腹侧神经和/或体壁肌肉。
在动物的四个角上放置四个图钉。现在打开中段。将别针放入解剖皿中，以便将动物切成薄片。
还要固定准备工作，以便使用镊子和剪刀进行教学。去除动物的消化器官、气管和脂肪体。用生理盐水冲洗制剂。
冲洗后，使用微型剪刀找到制剂的额叶和腹侧神经节。小心地切开额叶后面的腹侧神经节。解剖完成后，继续进行蓝光刺激和肌肉记录。
要进行肌肉记录，请拉一个 10 到 20 兆欧姆的电阻电极。使用电子电极拉拔器，用三摩尔的 KCL 填充拉出的电极。将装满的电极放入电极支架中。
现在将幼虫制剂放在钻机上的解剖显微镜下。调整蓝光，使解剖的制备物在光束中居中。使用微型纵器识别幼虫任何体壁段中的肌肉 6 或 M 6，小心地将电极插入 M 6 并观察快速超极化肌肉。
静息膜电位应为负 30 毫伏至负 70 毫伏之间的任何值。电极正确插入后，向控制电路提供 20 到 100 毫秒的电压脉冲。逐渐增加提供给控制电路的电压。
观察肌肉细胞中的兴奋连接电位。这是一个具有代表性的结果，显示了由短光脉冲引起的兴奋结电位。此处显示的兴奋期电位振幅是已知两个运动神经元的振幅总和。
M 六。较低的强度或较短的光持续时间可以暴露来自单个运动神经元的较小振幅兴奋性结电位。我们刚刚向您展示了如何在 oph 神经肌肉接头处没有两个介导的突触电位刺激的情况下进行通道路。
执行此程序时，请务必记住在解剖过程中不要损坏 prep 的体壁。同样重要的是要记住，虽然解剖后准备可能会过度兴奋，但随着时间的推移它会安静下来，并允许良好的记录。刺穿肌肉时，注意不要从第一层肌肉以下进入体壁。
当您的电极卡在体壁上时。您有时可以获得超极化电位，但实际上并不在肌肉细胞中。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
该程序使用蓝光激活的藻类通道和细胞特异性基因表达工具，通过在果蝇幼虫神经肌肉接点（NMJ）上的光脉冲来激发突触电位。这种技术是研究和教学实验室中用于突触生理学研究的一种廉价且易用的替代方法，替代了吸引电极刺激。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 突触生理学
- 基因表达
背景
- 果蝇幼虫常用于神经科学研究。
- 光激活通道提供了一种研究突触活动的非侵入性方法。
- 传统方法如吸引电极刺激可能复杂且昂贵。
- 该程序旨在简化激发突触电位的过程。
研究目的
- 开发一种使用光刺激研究突触生理学的方法。
- 为教育和研究目的提供一种可行的替代方法。
- 增强对神经肌肉接点突触机制的理解。
使用的方法
- 在特定食物上培养果蝇幼虫。
- 固定幼虫以准备刺激。
- 切断大脑和后神经以停止运动活动。
- 使用蓝色LED光源来激发突触电位。
主要结果
- 成功使用光脉冲激发了突触电位。
- 证明了蓝光激活的藻类通道的有效性。
- 验证了该方法作为传统技术的可靠替代方法。
- 在突触生理学研究中具有更广泛应用的潜力。
结论
- 光激活方法对研究神经肌肉接点生理学是有效的。
- 这种方法可以促进神经科学的研究和教学。
- 未来的研究可能探索这种技术的其他应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables non-invasive, light-based stimulation of synaptic activity in a genetically tractable model, reducing technical barriers in neurophysiology workflows. It supports reproducible data generation for target validation in early discovery, particularly where manual electrode manipulation limits throughput or training efficiency. The approach enhances predictive confidence by providing a standardized, scalable alternative to suction electrode stimulation in Drosophila neuromuscular junction studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic transmission mechanisms through precise, light-controlled neuronal activation.
- Operational Value: Reduces reliance on technically demanding suction electrode manipulation, improving assay consistency across users.
- Strategic Value: Supports high-fidelity phenotypic screening of genetic or pharmacological modifiers of synaptic function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable excitatory junctional potentials (EJPs) as a direct readout of neuromuscular transmission efficacy.
- Operational Value: Enables standardized stimulation parameters via blue LED pulse control, improving inter-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Facilitates assay miniaturization and adaptation for compound screening in Drosophila-based neurotoxicity or neurotherapeutic screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying conserved synaptic pathways with genetic accessibility.
- Operational Value: Allows longitudinal tracking of synaptic phenotypes in larval models with minimal preparation variability.
- Strategic Value: Supports mechanistic de-risking of targets involved in neuromuscular transmission or neurotransmitter release.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a stimulation modality for assessing synaptic function prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of neuronal excitability and synaptic vesicle release mechanisms via controlled light pulses.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable EJP amplitudes suitable for evaluating genetic or chemical perturbations.
- Analytics: Produces continuous voltage trace outputs enabling amplitude, rise time, and frequency analysis of synaptic events.
- Translational Research: Connects to conserved synaptic mechanisms relevant to human neuromuscular disorders through genetic orthology.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable stimulation platform adaptable across multiple larval genotypes and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing measurement variability from electrode placement artifacts.
- Operational Value: Improves lab throughput and training efficiency in teaching and research settings through simplified stimulation setup.
- Strategic Value: Lowers technical barriers to synaptic physiology assays, enabling broader team access and cross-functional collaboration.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions in target prioritization by providing reliable, high-fidelity synaptic readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, electrophysiology, and optical stimulation systems.
- Needs blue LED light source, voltage control circuit, and saline-based electrophysiology rig.
- Demands standardization of retinal feeding, larval staging, and dissection protocols across users.
- Limited to superficial muscle targets due to light penetration constraints in intact preparations.
- Dependent on functional ChR2 expression and co-factor (all-trans retinal) availability in motor neurons.
