制作生肌工程的组织结构
May 1st, 2009
在这里，我们展示了制造胶原蛋白为基础，组织骨骼肌成肌细胞构造。这些工程结构的3 - D可用于更换或修复组织在体内。对于我们而言，我们设计的这些电气管道修复完整的心脏传导阻滞房室。
该程序从从 Neonatal Lewis Wrathus 中收获骨骼肌组织开始。从该组织中，我们分离出成肌细胞。这些成肌细胞在组织培养皿上培养两天，然后收获并混合到基于胶原蛋白的组织构建混合物中。
将该混合物小心地移液到浸没在培养基中的模具中，并在 37 摄氏度下孵育。您好，我是来自波士顿儿童医院和哈佛医学院麻醉科 Douglas Cowan 实验室的 Christina Pesach。今天我们将向您展示一种创建肌源性工程组织的程序。
我们使用该程序来制造用于插入心脏的工程组织。我们的目标是在心脏的上腔室和下腔室之间建立电连接，作为完全心脏传导阻滞儿童心脏起搏器植入的替代疗法。那么让我们开始吧。
在结构中，铸模用于为手术植入的基于胶原蛋白的组织结构提供一种形式。在本视频中，随附的视频介绍了创建包含骨骼成肌细胞的工程组织构建体的过程。证明了该方案中制备的细胞化组织的心脏植入。
组织模具几乎可以制成任何形状或大小，以满足组织设计的任何心脏的生理要求。在这个演示中，模具将形成一块组织，可以将其切片以适合成年大鼠心脏的 AV 沟。使用剃须刀片将硅胶管切成三厘米长的块，然后将每块纵向切成两半，开始构建模具。
剪一小块涤纶网。接下来，在管材的最末端内侧滴一滴植入级 RTV 硅胶。尽量将沉积的粘合剂量保持在最低限度，因为它对培养的细胞有一定的毒性。
将一小块聚酯网快速放在硅胶胶滴上，并将其与管路末端对齐。这将为结构附件提供略微凸起和平坦的表面。对管路的另一端重复该过程。
让模具在室温下干燥三天。一次制作 20 到 30 个模具是有帮助的，因为这些模具基本上是一次性的。粘合剂完全干燥以帮助对模具进行消毒后，将它们存放在装满 70% 乙醇的容器中，直到需要它们并准备好模具。
接下来，确定所有必需的溶液是否也已准备好使用，为细胞分离做准备。用 1 毫克层粘连蛋白在 250 毫升 0.2 微米中制备稀释的层粘连蛋白溶液。过滤含有抗生素和杀菌剂的灭菌 PBS。
接下来，在 150 毫米组织培养板中涂上 4 毫升稀释的层压溶液，并在 37 摄氏度下孵育至少 4 小时，然后再使用。还必须准备另外两种解决方案。成肌细胞培养基和骨骼肌消化溶液。
有关其公式，请参阅协议的文本部分。滤波器。使用安装在 10 毫升注射器上的 0.2 微米滤盘对消化缓冲液进行消毒。消化缓冲液的等分试样可以储存在零下 20 摄氏度。
估计每窝 Lewis 鼠窝需要 5 毫升消化缓冲液。在 37 摄氏度下孵育所需量的组织消化缓冲液和 10 毫升成肌细胞培养基。然后继续解剖老鼠幼崽。
首先，使用镊子和小剪刀获得至少一窝处死的新生 Lewis 大鼠。通过沿脊髓切开背部，剥开皮肤和筋膜层，然后切除肌肉，从死去的新生 Lewis 大鼠身上去除椎旁肌肉。将切除的肌肉放入装满 40 毫升 X-H-B-S-S 的 50 毫升锥形管中，加冰。
让肌肉条沉降到管的底部，并在培养物中用无菌牧场移液器通过真空抽吸小心地去除大部分液体和血液残留物。接下来，将收获的肌肉块倒入 150 毫米的培养皿中，并尽可能多地吸出剩余的液体。使用两个单刃剃须刀片，将组织切碎成浓稠的糊状物。
肌肉糊将在预先警告的消化液中消化。将一些消化液倒在肌肉糊上，然后将溶液和肌肉糊混合物转移到新的 50 毫升试管中。通常使用 10 毫升移液器有效消化 3 升 Lewis 大鼠的肌肉，我们使用 10 至 15 毫升溶液。
将试管放在摇动平台上，在 37 摄氏度下消化约 30 分钟。在酶消化过程中，组织偶尔会发生 trid 而不起泡。将 10 mL 移液器安装在无线移液器上。
肌肉液化后，将溶液通过 70 微米细胞过滤器。然后用牧场移液管和吸力在室温下以 600 G 离心过滤后的细胞 10 分钟，吸出尽可能多的液体，并用 10 毫升温热的成肌细胞重悬沉淀。中等。在未包被的 150 毫米组织培养板上对细胞进行剖分 15 分钟，以帮助去除任何成纤维细胞，因为它们的附着速度比成肌细胞快。
将板放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中。从培养箱中取出板，转移尚未附着到 Lamin 包被培养物上的细胞。将它们佩戴并在成肌细胞培养基中稀释，以便每 1 到 2 只大鼠幼崽有一个板。
如果细胞铺板太密，它们会分化成肌管。最后，让细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿环境中生长。孵育 1 到 2 天后，细胞就可以铸造成组织构建体了。
孵育 1 到 2 天后，从培养箱中取出 4 个 150 毫米成肌细胞组织培养板。等待时间不要超过 48 小时，否则成纤维细胞会压垮成肌细胞群。从细胞中吸出培养基。
然后用一个加热至 37 摄氏度的 XPBS 冲洗细胞两次，以将成肌细胞从板中分离，并向每个板中加入 4 毫升加热的 0.05%tryin EDTA 溶液，然后将板放回培养箱中 5 分钟。在培养罩中收获成肌细胞，并将液体收集在 50 毫升管中。使用 10 毫升成肌细胞培养基冲洗所有板，并将其与离心管中的细胞混合。
在室温下以 600 G 的离心力沉淀细胞 10 分钟，并尽可能多地吸出多余的液体。现在将成肌细胞重新悬浮在 1.4 毫升成肌细胞培养基中，并将它们置于冰上。小心地使用镊子，从乙醇浴中取出构建模具，浸入一个 XPBS 中冲洗两次，用牧场移液管吸出所有痕量的 PBS，然后将模具放入六孔组织培养板的空孔中。
这时候，必须制定一个解决方案。在冰上收集以下试剂。10 x 火腿 F 10 真菌区青霉素链霉素。
1 型胶原细胞重悬于成肌细胞、培养基碳酸氢钠和凝胶中。根据书面方案混合试剂。将混合物涡旋 20 秒，它会变成粉红色。
请注意，市售的 1 型胶原蛋白品种对混合物、凝固和稠度的影响各不相同。在最终产品中。将管子放回冰桶中几分钟，以清除溶液中的气泡。
这是 1 型胶原蛋白没有受到照射或不会糊化。在这里，我们使用一种源自 ovide 皮肤的产品。在混合物凝固之前，小心地将混合物倒入培养板中的模具中。
每个模具可容纳大约 1 毫升的粘性液体。在此过程中尽量避免引入气泡。小心地将包含构建模具的板转移到 37 摄氏度的培养箱中。
随着混合物凝固，它会从深粉红色变为浅粉红色，而霉菌凝固会将一些成肌细胞培养基加热到 37 摄氏度。孵育约半小时后，小心地将每个组织构建体浸入加热的成肌细胞培养基中，然后将板放回培养箱中。当该方案正确执行时，含有成肌细胞的组织构建体即可用于体内植入或进一步分析。
经过两天的孵化，我们刚刚向您展示了如何制造肌源组织工程结构。执行此程序时，请务必记住将构建溶液所需的所有试剂保存在冰上，以防止过早凝固。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文展示了含有骨骼肌母细胞的胶原基组织构建物的制造，设计用于作为房室电导管修复完全性心脏传导阻滞。这些构建物被设计用于在体内潜在替代或修复损伤的组织。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 心血管修复
- 肌母细胞培养
背景
- 胶原基构建物对于组织工程至关重要。
- 骨骼肌母细胞在肌肉修复中起着至关重要的作用。
- 心脏传导阻滞是一种需要创新修复策略的重要医学情况。
- 3-D 工程组织可以模仿自然组织特性。
研究目的
- 创建一个可行的心脏修复组织构建物。
- 探索在工程组织中使用肌母细胞的可能性。
- 研究胶原基支架在再生医学中的潜力。
使用的方法
- 从新生 Lewis 大鼠中收集骨骼肌组织。
- 分离和培养肌母细胞。
- 将肌母细胞与胶原基组织构建物混合物混合。
- 将混合物通过移液器移入模具中并在 37 摄氏度下孵育。
主要结果
- 成功制造了含有肌母细胞的胶原基构建物。
- 证明这些构建物具有作为电导管的潜力。
- 建立了一种创建肌源性工程组织的方法。
- 在修复心脏传导阻滞条件下的潜在应用。
结论
- 该研究为心脏应用的组织工程提供了一种新颖的方法。
- 胶原基构建物显示出在体内组织修复的潜力。
- 需要进一步的研究来优化这些构建物以供临床使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Engineered myogenic tissue constructs offer a biologically adaptive alternative to electronic pacemakers for pediatric cardiac rhythm disorders, addressing challenges of growth and device longevity. This fabrication protocol enables the creation of customizable, implantable tissues that can serve as electrical conduits, supporting translational research in regenerative cardiac therapies. The approach positions biopharma teams to explore next-generation solutions for congenital heart block and related indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions relevant to cardiac conduction restoration.
- Supports biological de-risking by validating functional integration of myoblasts within engineered matrices.
- Facilitates predictive confidence in tissue construct viability for downstream translational studies.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for preparing standardized tissue constructs for in vitro and in vivo assessment.
- Enables quantitative evaluation of construct morphology, cell viability, and electrical properties.
- Supports scalability and adaptation of constructs to various physiological requirements and model systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered tissue properties with disease-relevant cardiac models for preclinical validation.
- Enables continuity from discovery-stage fabrication to surgical implantation and functional assessment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for regenerative cardiac therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This fabrication protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling iterative optimization of tissue constructs for cardiac repair applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell integration and matrix compatibility for cardiac conduction.
- Screening: Provides assay-ready constructs for reproducible in vitro and in vivo evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of construct integrity, cell viability, and functional properties.
- Translational Research: Bridges engineered tissue fabrication with preclinical implantation studies in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable protocol for diverse tissue engineering and regenerative medicine initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in engineered tissue performance and integration.
- Operational Value: Standardizes construct fabrication for reproducibility and scalability across research teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for advancing regenerative cardiac therapies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of tissue engineering assets for pediatric and congenital indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, tissue engineering, and sterile technique.
- Demands access to cell culture, biomaterial preparation, and analytical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of construct formulation and quality control.
- Adaptable to various animal models and construct geometries based on research needs.
- Dependent on source and quality of collagen and myoblasts for reproducible outcomes.
