肌源性工程组织构建物的制备

该实验流程首先从新生Lewis大鼠中收获骨骼肌组织。从该组织中分离出成肌细胞。这些成肌细胞在组织培养皿中培养两天后，被收集并混入基于胶原蛋白的组织构建物混合物中。

将此混合物小心地用移液管移入浸没在培养基中的模具内，并在37摄氏度下孵育。大家好，我是Christina Pesach，来自波士顿儿童医院和哈佛医学院麻醉学系Douglas Cowan实验室。今天我们将向您展示一种构建肌源性工程组织的实验方法。

我们采用此方法制备一种用于植入心脏的工程化组织。我们的目标是在心脏的上、下腔室之间建立电连接，作为对患有完全性心脏传导阻滞的儿童进行心脏起搏器植入的一种替代疗法。现在我们开始操作。

在该构建过程中，使用铸造模具为可手术植入的基于胶原的组织构建物提供形状。本视频中，随附视频描述了包含骨骼肌成肌细胞的工程化组织构建物的制备过程。本方案中制备的细胞化组织的心脏植入操作也已展示。

组织模具可以制成几乎任意形状和尺寸，以满足所设计组织对应心脏的生理需求。在本演示中，该模具将形成一块组织，可将其切片后植入成年大鼠心脏的房室沟中。首先使用剃刀片将硅胶管切成三厘米长的段，然后沿长度方向将每一段从中间切开，得到半圆形的硅胶条。

剪下一小块聚酯网。接着，在导管末端内侧滴一滴植入级室温硫化（RTV）硅胶粘合剂。尽量减少粘合剂的用量，因为其对培养细胞具有一定的毒性。

迅速将一小块聚酯网片放置在硅胶粘合剂液滴上，并与管端对齐。这将为构建物的附着提供一个略微抬高且平整的表面。对管子的另一端重复此操作。

将模具在室温下干燥三天。一次制作 20 至 30 个模具会比较方便，因为这些模具基本上是一次性使用的。待粘合剂完全干燥以帮助对模具进行灭菌后，将模具存放在装有 70% 乙醇的容器中，直至需要时取出使用。

接下来，确定所有必需的溶液是否也已准备好用于细胞分离。为准备细胞分离，配制稀释的层粘连蛋白溶液，即将1毫克层粘连蛋白溶于250毫升含有抗生素和抗真菌剂的0.2微米滤器过滤除菌的PBS中。

下一步，用4毫升稀释后的层粘连蛋白溶液包被150毫米的组织培养皿，并在使用前于37°C孵育至少4小时。还需准备另外两种溶液：成肌细胞培养基和骨骼肌消化液。

请参阅方案文本部分以获取其配方。过滤：使用安装在10毫升注射器上的0.2微米滤膜对消化缓冲液进行灭菌。消化缓冲液可分装后于-20摄氏度保存。

预计每窝Lewis大鼠需要5毫升消化缓冲液。将所需量的组织消化缓冲液以及10毫升成肌细胞培养基置于37摄氏度预热。随后开始解剖仔鼠。

首先，使用镊子和小剪刀获取至少一窝经处死的新生Lewis大鼠。沿脊髓纵向切开背部，剥离皮肤和筋膜层，然后切除脊柱旁肌肉。将切除的肌肉置于含有40毫升冰上预冷的1×H-B-S-S溶液的50毫升锥形管中。

让肌肉条自然沉降至管底，然后在培养条件下用无菌移液管通过真空抽吸小心除去大部分液体和血迹残留。接着，将收获的肌肉组织块倒入直径150毫米的培养皿中，并尽可能吸除剩余液体。使用两片单刃剃须刀片将组织切碎至呈浓稠糊状。

将肌肉糊置于预热的消化液中进行消化。取部分消化液加入肌肉糊中，混匀后将混合液转移至新的50毫升离心管中。通常使用10毫升移液器，为有效消化三升Lewis大鼠的肌肉组织，我们使用10至15毫升消化液。

将离心管置于摇床上，于 37 摄氏度消化约 30 分钟。在酶消化过程中，偶尔用装有无线移液器的 10 毫升移液管轻轻吹打组织，避免产生气泡。

待肌肉组织完全液化后，将溶液通过70微米细胞滤网过滤。随后在室温下以600 ×g离心10分钟，使用巴氏吸管和抽吸装置尽可能吸除上清液，并用10毫升预温的成肌细胞培养基重悬细胞沉淀。将细胞接种于未包被的150毫米组织培养皿中，预贴壁15分钟，以去除成纤维细胞，因为成纤维细胞贴壁速度较成肌细胞更快。

将培养板放入设置为37摄氏度、含5%二氧化碳的加湿培养箱中。从培养箱中取出培养板，转移尚未贴壁的细胞至Lamin包被的培养物中。用成肌细胞培养基重悬并稀释细胞，使每1至2只大鼠幼崽对应一孔培养板。

如果细胞铺板过密，它们将分化为肌管。最后，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润环境中培养。经过一至两天的孵育后，细胞即可用于组织构建体的制备。

孵育一至两天后，从培养箱中取出四个150毫米的成肌细胞组织培养皿。不要超过48小时，否则成纤维细胞将大量增殖并压倒成肌细胞群体。吸除细胞中的培养基。

然后用预热至 37 摄氏度的 1 倍 PBS 缓冲液洗涤细胞两次，以使成肌细胞从培养板上脱落，并向每块培养板中加入 4 毫升预热的 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，将培养板放回培养箱中孵育 5 分钟。在超净工作台中收集成肌细胞，并将液体转移至 50 毫升离心管中。用 10 毫升成肌细胞培养基冲洗所有培养板，并将冲洗液与离心管中的细胞混合。

在室温下以 600 G 离心 10 分钟收集细胞，尽可能吸除上清液。随后将成肌细胞重悬于 1.4 毫升成肌细胞培养基中，并置于冰上。使用镊子小心地从乙醇浴中取出一个支架模具，将其浸入 1 倍 PBS 中冲洗两次，再用移液管彻底吸除 PBS 残留液，然后将模具放入六孔组织培养板的一个空孔中。

此时必须配制溶液。将以下试剂置于冰上收集：10 × Hams F10 培养基、10 倍真菌区青霉素-链霉素溶液。

将重悬于成肌细胞培养基、碳酸氢钠和凝胶中的I型胶原细胞混合。按照书面方案所述步骤混合试剂。涡旋振荡混合物20秒，溶液将变为粉红色。

请注意，市售的一型胶原蛋白种类繁多，其对混合物、凝固性和一致性的效果存在差异。在最终产品中，将试管放回冰桶中数分钟，以去除溶液中的气泡。

这是因为Ⅰ型胶原蛋白不能经过辐照，否则会变成明胶。此处我们使用源自 ovine 皮肤的产物。在混合物凝固之前，小心地将混合物倒入培养板中的模具内。

每个模具可容纳约一毫升黏性液体。操作过程中应尽量避免产生气泡。小心将含有构建模具的培养板转移至37摄氏度培养箱中。

随着混合物凝固，其颜色将由深粉色变为浅粉色，同时将一些成肌细胞培养基预热至37摄氏度。经过约半小时的孵育后，小心地将每个组织构建物浸入预热的成肌细胞培养基中，并将培养板放回孵育箱。当本方案正确执行时，含有成肌细胞的组织构建物即可用于体内移植或进一步分析。

经过两天的孵育后，我们刚刚向您展示了如何制备一种肌源性组织工程构建物。在进行此操作时，重要的是要记住将构建物溶液所需的所有试剂保持在冰上，以防止过早固化。就是这样。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。