Name: 光学测绘的Langendorff灌注大鼠心脏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学习使用电位敏感染料di-8-ANEPPS对大鼠心脏进行光学标测，以高时空分辨率记录动作电位在心脏表面的传播过程，为研究心脏电生理和心律失常机制提供重要方法。

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本工作由美国国立卫生研究院的研究基金（HL068915；HL088206）以及波士顿儿童医院心脏传导基金的捐款资助。

第1部分：配制溶液及准备离体灌流心脏系统
<ol>
<li>实验当天早晨，按先前所述方法配制 4.0 L 的 Krebs-Henseleit 溶液[5, 6]。</li>
<li>将 11 mMol/L 的 2,3-丁二酮单肟（BDM）溶解于步骤 1.1 中配制的灌流液分装出的 1.0 L Krebs-Henseleit 溶液中。</li>
<li>从步骤 1.1 配制的灌流液中另取出 150 mL，与 5 Mol/L 的 di-8-ANEPPS（用二甲基亚砜（DMSO）稀释自 10 mMol/L 储存液）混合。</li>
<li>将上述三种溶液转移至带水套的玻璃储液瓶（Radnoti）中，预热至 41.0°C，并使用浸入式鼓泡器（Radnoti）以经 0.2 μm 滤膜过滤的 95% O2 和 5% CO2 混合气体进行氧合。三种储备液通过 MasterFlex™ L/S 蠕动泵和低吸附性硅胶管（Cole-Parmer）输送至壁挂式 Langendorff 系统。</li>
<li>在组装前，Langendorff 系统的玻璃器皿（Radnoti）需用 E-TOXA-CLEAN 试剂（Sigma-Aldrich）仔细清洗，并依次用 0.1 M/L HCl、100% 乙醇和蒸馏水充分冲洗。</li>
<li>该非循环 Langendorff 装置设计为从三个独立的氧合储液瓶提供 70 mm Hg 的恒定压力，储液瓶与心脏之间设有带水套的加热线圈和气泡捕获装置（Radnoti）[7]。三条独立的灌注管路在心脏上方通过两个三通旋塞汇合，使我们能够精确控制步骤 1.1 至 1.3 所配制溶液的输送。带水套的玻璃器皿通过 MasterFlex PharMed BPT 管路（Cole-Parmer）串联连接，并利用两台 E100 循环水浴（Lauda）以蒸馏水加热至 39°C。由于连接压力储液瓶与加热线圈及气泡捕获装置的铂固化硅胶管（Cole-Parmer）存在热量散失，最终到达心脏的灌流液温度为 37°C。</li>
</ol>
第二部分：收获大鼠心脏并建立兰格多夫灌流
<ol>
<li>为对体重200-250 g的Lewis大鼠诱导深度全身麻醉，需向腹腔内注射100 mg/kg氯胺酮（Ketamine）和10 mg/kg赛拉嗪（Xylazine）。在此混合液中加入500 U/kg肝素（Heparin），以防止摘取器官过程中发生血液凝固和心肌缺血。</li>
<li>为便于暴露心脏及大血管，需切除前胸壁。随后仔细分离周围组织，并打开心包囊。</li>
<li>确认下腔静脉后，用5-0丝线（Ethicon）结扎该血管，并完整摘取心脏-肺组织块。立即将组织置于盛有冰冻Krebs-Henseleit溶液的50 mL烧杯中，烧杯置于冰上。</li>
<li>迅速识别并分离升主动脉，将合适尺寸的套管（Harvard Apparatus）插入主动脉，注意避免因插入过深而阻断冠状动脉的必要灌注。用5-0丝线（Ethicon）将套管固定于升主动脉。</li>
<li>将大鼠心脏置于Langendorff装置上，注意避免向套管内引入气泡。利用步骤1.6中所述压力源提供的温热且含氧的Krebs-Henseleit溶液，开始逆向冠状血管灌注。</li>
<li>去除包括肺在内的多余组织，心脏继续灌注20分钟，以恢复其功能并稳定心律。在此期间，将一根极细的热电偶温度探针（Cole-Parmer）插入左心室腔内，并用5-0 Prolene缝线（Ethicon）缝合固定。将探针连接至温控仪（Digi-Sense），通过调节循环水泵的设置，确保心脏温度维持在37°C。在流出液收集容器中放置一块纱布，以减少心尖滴液引起的运动干扰。</li>
</ol>
第3部分：用心电位敏感染料负载心脏并获取电图和光学信号
<ol>
<li>Di-8-ANEPPS（Invitrogen）通过三通阀切换至含有荧光染料与Krebs-Henseleit溶液混合液的灌注管路，从而加载至心脏。此外，将18G套管插入左和/或右心房，并向每个心房腔室缓慢注入额外50 mL染料溶液，因为经冠状动脉灌注的染料无法充分灌注这些腔室。</li>
<li>在加载过程中，将3个心电图导联（Harvard Apparatus）轻轻放置于心脏表面不朝向映射所用光学系统的一侧。电极No 1 位于左心室的后顶部，No 左心房上的2和No 3 作为主动脉根部的参考电极（图1）。心房和心室的电图信号随后通过软件（RedShirt Imaging）进行放大、数字化，并与光学信号一同显示（图2）。同时使用示波器（Tektronix 型号 TDS 1002）实时观察体表心电图，以确保起搏效果适当。</li>
<li>ECG 放大器（Hugo Sachs Elektronik）设置： 
高通滤波器：0.1 Hz 低通滤波器：150 Hz</li>
<li>使用X-Y-Z调节装置调整CMOS相机（RedShirt Imaging）和宏观成像系统的位置，使心脏表面在采集画面中清晰对焦并居中。相机与光学系统安装在减震台（Minus K Technology）上，以最大限度减少共振频率的影响。同时，将一根同轴起搏电极（Harvard Apparatus）连接至隔离式S48电刺激仪（Grass），放置于右心房，并以每分钟300次的频率进行心脏起搏（图1）。</li>
<li>电刺激（Grass）设置： 频率：每秒5次脉冲 延迟：0.2 ms 持续时间：2 ms 电压：6-12 V 模式：重复 脉冲：单次</li>
<li>为了获得无收缩运动伪影的光学记录，需要将心脏进行电-机械去耦联。我们通过再次切换灌注管路至含有11 mmol/L BDM的Krebs-Henseleit溶液来实现这一操作。在各次数据采集之间，使用未经添加物的Krebs-Henseleit溶液灌注心脏，以帮助维持组织的活性。</li>
<li>使用软件（RedShirt Imaging）设置以下采集参数： 配置：2,000 Hz；128×128 像素阵列 帧间隔：0.5 ms 相机放大器增益：5倍 片上增益：8x-12Me-阱 快门：500 毫秒延迟 帧数：4000 持续时间：2000 ms</li>
<li>关闭或遮蔽所有房间和设备的光源，以消除记录过程中的背景噪声。LED光源仅在光学记录期间照射心脏，以减少光漂白和染料毒性。光源快门通过计算机中的D/A板（RedShirt Imaging）经由控制面板输出5 V脉冲进行控制。</li>
</ol>
第4部分：使用RedShirt Imaging软件分析采集信息
<ol>
<li>采集完成后，使用不同的滤波设置对数据进行处理。通常使用默认设置，仅在调整带阻/带通滤波器时例外，此时将左边界设为 44.0，右边界设为 98.0。随后对记录的信息进行处理，并生成视频（RedShirt Imaging）。</li>
<li>一次采集的数据对应于心脏表面 16,384 个位点在 2 秒时间内的局部电激活情况。该软件可将这些局部信号相互直接比较，并与心房和心室的心电图记录进行比较。然后通过将局部电激活映射为颜色，并将此信息渲染为动画，以显示心脏表面的时空电激活过程。为生成此类动画，我们使用软件进行以下操作：
<ul>
<li>对数据进行时间上和/或空间上的滤波</li>
<li>选择动画的起始和结束时间</li>
<li>根据每个像素的静息光强度将光信号映射为颜色</li>
<li>将生成的颜色数据与心脏图像叠加</li>
<li>生成动画</li>
</ul>
</li>
</ol>
第5部分：代表性结果
如果在记录期间灌注心脏制备物保持静止，则每个参与di-8-ANEPPS发射光强度变化的像素所对应的光学信号均显示一个明显的单峰。相应的视频（图3和图4）展示了兴奋波在心脏心外膜表面的传播，以及同步采集的心电图记录（图2）。
<img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="用于心脏起搏研究的朗根多夫心脏装置示意图，突出显示编号的组件。" data-altupdatedat="1754904545000" data-alt="图 1"> 图 1. 一幅朗根多夫灌注心脏制备的照片，显示了步骤 3.2 中所述的位于右心房的起搏电极和心电图导联的位置。
<img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="显示信号的生物过程示意图；荧光显微镜结果的数据分析。" border="0" data-altupdatedat="1754904545000" data-alt="图 2"> 图 2. 来自灌注的Lewis大鼠心脏的代表性光学信号与电图记录。图A显示用于光学成像的心外膜表面图像。图B中用彩色箭头标示了用于展示荧光发射随时间变化的像素位置。图C显示电图信号，其中红线表示心房激活，浅蓝色线对应心室信号。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg">点击此处</a>查看该图的放大版本。

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

动物实验严格按照波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。

从麻醉大鼠体内取出心脏必须迅速进行，以避免心肌缺血。如果发生缺血或冠状动脉灌注不足，心脏很可能出现心律失常，并可能发生梗死。此外，这些心脏将表现出荧光发射不足，无法获得可用于有效记录和后续分析的数据。在加载染料之前，必须用心肌细胞充分灌注Krebs-Henseleit溶液，以建立并维持生理电解质环境，从而保证电冲动的稳定性。准确配制灌流液对于维持器官的正常存活性和功能也十分必要。灌流液中电解质浓度的差异或过滤不充分，均可能导致致命的心肌功能障碍和心律失常。对于光学记录，心脏必须完全负载电压敏感性染料。这一点对于心房心肌尤为重要，因为这些腔室的冠状动脉灌注较差。我们发现，对心房进行额外的腔内灌注可获得良好的光学信号。此外，要获取高质量的电压追踪信号，灌流心脏必须保持静止；否则，由于信号漂移引起的人工伪影，荧光发射的变化将无法可靠地高保真反映膜电位的变化，这会导致单个像素出现多个峰，而非单一峰。其他消除光学记录中运动伪影的方法包括机械固定、使用其他兴奋-收缩解偶联剂（如细胞松弛素D、blebbistatin）、信号处理以及数学建模[1, 8]。最后，本文所述方法仅提供有关动作电位在心脏心外膜表面传导的信息。其他组织制备...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>设备</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CardioPlex 软件</td><td>设备</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUXEON LED 光源 460-490 nm </td><td>设备</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>ECG 放大器 Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>设备</td><td>哈佛仪器公司</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>505 nm 二向色镜</td><td>设备</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>605 nm 长通发射滤光片</td><td>设备</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT 侧向支架</td><td>设备</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>微型球形关节支架</td><td>设备</td><td>哈佛仪器公司</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>小型刺激电极组</td><td>设备</td><td>哈佛仪器公司</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>BM-6 台式振动隔离平台</td><td>设备</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>单极 ECG 电极</td><td>设备</td><td>哈佛仪器公司</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>滚轮泵 SCI 400</td><td>设备</td><td>Watson-Marlow 泵业集团</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>滚轮泵 MasterFlex Easy Load II</td><td>设备</td><td>Cole-Parmer</td><td>型号 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Marprene #14 管路</td><td>设备</td><td>Watson-Marlow 泵业集团</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex 管路</td><td>设备</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>S48 方波脉冲刺激器</td><td>设备</td><td>Grass Technologies</td><td>型号 S48</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 射频变压器隔离单元</td><td>设备</td><td>Grass Technologies</td><td>型号 SIU5</td><td></td></tr><tr><td>5 升水套式储液槽</td><td>设备</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>2 升水套式储液槽</td><td>设备</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>0.5 升水套式储液槽</td><td>设备</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>0.25 升水套式储液槽</td><td>设备</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 加热盘管</td><td>设备</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>顺应性气泡捕获器</td><td>设备</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Luer 断开式套管</td><td>设备</td><td>哈佛仪器公司</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>三通止流阀，FLL 转 MLT，无端口盖</td><td>设备</td><td>哈佛仪器公司</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>热电偶温度计</td><td>设备</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Fine IT 系列柔性微探针</td><td>设备</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>示波器 Tektronix TDS 1002</td><td>设备</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>试剂</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>试剂</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

离体灌注大鼠心脏的光学标测

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

使用电压敏感性荧光染料对心脏表面进行光学标测，已成为研究从细胞培养到完整器官等不同尺度实验模型中电兴奋活动的重要工具[1, 2]. 利用先进的光学成像系统，几乎可以实时可视化正常心律期间或心律失常发生与维持过程中动作电位的产生与传播[1]. 最新上市的商用系统能够提供极高的时空分辨率信息，这些系统最初是基于自行构建的设备开发的，旨在克服传统电生理学方法所带来的局限性[1]. 高分辨率和高速互补金属氧化物半导体（CMOS）相机、高亮度发光二极管（LED）、电压敏感染料、光学元件及滤光片的不断进步，已使电生理信号的采集对更习惯使用显微镜的心血管细胞生物学家而言变得切实可行。尽管最新一代的CMOS相机可在16,384像素阵列上实现每秒10,000帧的采集速度，但根据样本制备类型的不同，已广泛应用的荧光信号采集技术（如光电二极管阵列、激光扫描系统和冷却电荷耦合器件（CCD）相机）在动态范围、信噪比和量子效率方面仍具有一些明显优势。[1, 3]. 在本研究中，大鼠心脏被灌注ex vivo使用改良的Langendorff装置，以37°C的晶体灌注液（Krebs-Henseleit溶液）进行灌注。经过20分钟的稳定期后，心脏间歇性地灌注11 mmol/L的2,3-丁二酮单肟，以消除图像采集期间与收缩相关的心肌运动。对于光学标测，我们用心肌细胞膜电位快速响应探针di-8-ANEPPS对心脏进行负载。[4] （5 μMol/L）并用475±15 nm激发光短暂照射样本。在典型的2秒照射期间， &gt;使用连接至水平体视显微镜的高速CMOS相机采集离体心脏标本发出的605 nm光信号。在本演示中，通过连接至独立电刺激仪的同轴电极以300次/分钟的频率起搏心脏。同步获取双极心电图记录，并与电压信号一起使用常规软件进行分析。通过该方法，可对Langendorff灌注大鼠心脏表面的动作电位进行可视化观察，并与心电图信号同步记录。

本文介绍了一种高时间和空间分辨率的技术，利用电位敏感染料（di-8-ANEPPS）对离体灌注的大鼠心脏表面动作电位的传播进行光学成像。

使用电压敏感性荧光染料对心脏表面进行光学标测已成为研究心脏电兴奋的重要工具。

您好，我是来自儿童医院和霍华德医学院麻醉科Cohen博士实验室的Yon Ziv。今天我们将展示在Lal灌注的红色心脏中进行光学标测的实验步骤。在我们的实验室中，该方法用于研究心脏表面电活动的传播。那么我们开始吧。实验当天早上，配制4升Krebs Henselit溶液。溶液配制完毕后，使用真空过滤法，通过200微米滤膜去除未溶解的颗粒。首先，使用一升配制好的Krebs Henzel lite溶液溶解11毫摩尔的BDM。其次，取另外100毫升Krebs Henzel lite溶液，并加入DMSO中10毫摩尔的D eight NFS，使溶液中D eight annex的终浓度为5微摩尔。此处使用的带水夹套玻璃储液瓶、鼓泡器及玻璃器皿均来自red.Naughty。将两种溶液转移至预热至41摄氏度的储液槽中。使用浸入式鼓泡泵，以0.2微米过滤的气体对溶液进行氧合，并通过壁挂式Ling Endorf系统，利用蠕动泵和低吸附硅胶管将来自三个储备储液槽的溶液输送，以获取大鼠心脏。首先，对一只200至250克的Lewis大鼠进行腹腔注射，给予氯胺酮和赛拉嗪以诱导深度全身麻醉，同时注射肝素以防止在处死取心过程中发生血液凝固和心肌缺血。当大鼠完全麻醉且对脚趾夹捏无反应时，即可开始取出心脏。手术首先移除胸壁前部，以便于接触心脏和大血管。随后仔细分离周围组织，并打开心包膜囊。确定下腔静脉后，用五根0号聚丙烯缝线结扎该血管，并取出完整的心肺组织块。立即将组织置于盛有冰冷克雷布斯-亨泽尔轻液的50毫升烧杯中，并将烧杯置于冰上，迅速辨认升主动脉并从周围组织中分离出来。将合适尺寸的导管插入主动脉。注意避免将导管插入主动脉根部过深，以免影响冠状动脉的必要灌注。将导管固定于升主动脉，随后将大鼠心脏置于Langendorff装置上，操作过程中避免向导管内引入气泡。现在使用温热的含氧克雷布斯-亨塞尔莱特溶液进行逆行冠状血管灌注。从林格-恩多夫装置的压力头处，在清理后去除包括肺脏在内的多余组织，对心脏灌注20分钟，以使心脏功能恢复并稳定节律。将一根极细的热电偶温度探针插入左心室腔内。使用五根5-0 Prolene缝线将探针固定到位，并调节水循环泵的设置以维持心脏温度在37摄氏度。通过将一块纱布置于流出液收集容器中，尽量减少心尖处灌注液滴落引起的心脏运动。此时心脏已准备好加载电位计量染料，以获取电生理和光学信号，将电位计量染料Di-8-ANEPPS载入心脏。切换至含有克雷布斯液的灌注管路，该液体为混有荧光染料的透明溶液。由于通过冠状动脉灌注的染料无法充分灌注心房，因此需将一根18号套管插入左心房和/或右心房，并向每个心房内缓慢注入额外的50毫升染料溶液。在加载过程中，轻轻地将三个心电图导联放置在心脏表面，该表面不朝向用于成像的光学器件。第一个电极置于左心室的后侧心尖部位。第二个电极置于左心房，第三个电极作为参考电极置于主动脉根部。随后，心房和心室的电图信号通过软件进行放大、数字化并显示为光学信号。同时使用示波器实时观察体表心电图，以确保起搏效果良好。将心电图放大器的高通滤波器设置为0.1赫兹，低通滤波器设置为150赫兹。使用X、Y、Z调节装置调整CMOs相机的位置。将一块玻璃置于相机的焦平面上，并放置在心脏表面，使感兴趣区域处于焦点中心并位于采集画面中央。相机和光学系统安装在隔振台上，以尽量减少共振频率的影响。同时，在右心房放置一根由隔离式 S 48 电刺激仪控制的同轴起搏电极。该电极将以每分钟 300 次的频率起搏心脏，请按如下方式设置电刺激参数。刺激参数应设置为每秒五个脉冲，延迟0.2毫秒，刺激持续时间2毫秒，刺激强度为6至12伏，模式设为重复单脉冲。对于需要消除收缩引起运动伪影的光学记录，需将心脏进行电-机械解耦。方法是再次切换灌流管路至含有11毫摩尔BDM的Krebs Hensel溶液。两次采集之间，用纯净的Krebs-Henseleit溶液灌注心脏，以维持组织的活性。将软件记录参数设置为2000赫兹，像素阵列为128 × 128。帧间隔应设置为 0.5 毫秒，相机放大器增益应设置为 5 倍，片上增益应设置为 8 倍。片上增益还应设置为 12。将软件中的相机控制设置为 500 毫秒的快门延迟，并以 2000 毫秒的持续时间记录 4,000 帧。关闭或遮蔽所有室内和设备光源，以消除记录过程中的背景噪声，仅在光学记录期间由LED光源照射心脏。为减少光漂白和染料毒性，通过计算机中的D/A板经控制面板发送5伏脉冲来控制光源快门。使用不同的滤波器设置处理数据。通常使用默认设置，除非调整带阻滤波器，此时将左边界设为44.0，右边界设为98.0。随后，对记录的信息进行处理并用于生成视频。一次采集的数据对应于心脏表面16,384个位点在两秒钟内的局部电激活情况。该软件可将这些局部信号相互之间以及与心房和心室的电图记录数据进行直接比较，方法是将局部电激活映射为颜色，并将此信息渲染为动画，显示心脏表面的时空电激活过程。要创建此类动画，首先使用软件对数据进行时间上和/或空间上的滤波处理，然后选择动画的开始时间和结束时间。第三，根据每个像素的静息光强度将光学信号映射为颜色。第四，将生成的颜色数据与心脏图像叠加，最后，如果灌注心脏标本在记录期间保持静止，则生成动画。在记录过程中，每个参与D-8-ANEPPS发射强度变化的像素的光学信号均显示出一个明显的峰值。这些实时成像视频展示了兴奋波在心脏心外膜表面的传播过程，以及同步采集的心电图记录。我们刚刚演示了一种高分辨率技术，用于在阿兰诺灌注红心表面光学成像动作电位的传播。进行此操作时，重要的是要迅速将心脏从麻醉后的红心中取出。为避免心肌缺血，必须充分灌注心肌细胞，并确保心脏完全负载水敏感性染料。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

光学测绘的Langendorff灌注大鼠心脏

本报告详细描述了在拉伸诱导心房颤动期间，对离体羊心左心房进行Langendorff灌注状态下同步心内膜和心外膜电兴奋光学标测的方法学与结果。...

用于拉伸诱导心房颤动研究的绵羊模型中的高分辨率心内膜与心外膜光学标测

本文介绍了使用全景成像系统和双模态（电压和钙）成像技术，在离体兔心Langendorff灌流心脏上进行光学标测实验的基本操作步骤。...

离体兔心Langendorff灌注的多参数光学标测

本文详细介绍了在完整分离的Langendorff灌注小鼠心脏中进行跨膜电位（Vm）和细胞内钙瞬变（CaT）光学标测时的解剖操作、仪器设置及实验条件。...

小鼠心脏动作电位与钙瞬变的光学标测

在本视频中，我们对离体小鼠心脏进行朗根多夫逆向灌流。在操作过程中，将导管插入升主动脉，通过冠状动脉逆向灌注灌流液，以维持心脏的生理活动。该模型用于研究心脏的病理生理学机制。...

朗根多夫逆行心脏灌注：一种离体灌注小鼠离体心脏的技术

离体大鼠心脏是研究缺血再灌注损伤的经典模型。本文描述了通过以下步骤从大鼠体内获取跳动心脏的过程 原位...

离体灌注大鼠心脏中缺血-再灌注损伤的诱导与评估

本文介绍了在经Langendorff灌注的兔心脏中进行跨膜电位（Vm）和肌浆网内游离钙离子（SR Ca2+）双光学标测所需的详细方案及设备。该方法可实现对完整心脏中Vm和SR...

兔心Langendorff灌注模型中肌浆网内Ca2+及跨膜电位的光学标测

本文介绍了一种以高空间和时间分辨率对小鼠右心房特别是窦房结的电活动进行光学标测的实验方案。...

小鼠窦房结的高分辨率光学标测

本方案描述了利用具有高时间分辨率和空间分辨率的光学标测系统对小鼠心房进行电生理学评估的方法，包括通过特制电极导管进行程序化刺激，同步记录膜电位和Ca2+瞬变信号。...

小鼠心房的高分辨率光学标测电生理学评估

本研究的目的是建立一种利用转化动物模型研究心脏动力学的方法。所述实验方法结合了双发射光学生理记录技术与电生理学研究，以评估离体完整猪心脏模型中的电活动。...

离体Langendorff灌注心脏的光学心电图与电生理学研究

本方案介绍了对来自野生型及患有儿茶酚胺能多形性室性心动过速的基因敲入型小鼠心脏进行的双染料光学标测，包括以高时间和空间分辨率记录跨膜电压和细胞内Ca2+瞬变的电生理学测量。...

儿茶酚胺能多形性室性心动过速 RyR2R2474S 基因敲入小鼠心脏的双染料光学标测

学习使用电位敏感染料di-8-ANEPPS对大鼠心脏进行光学标测，以高时空分辨率记录动作电位在心脏表面的传播过程，为研究心脏电生理和心律失常机制提供重要方法。

离体灌注大鼠心脏的光学标测

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