活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

活细胞成像在研究细胞器运输动力学时尤为有用。本视频将重点介绍一种用于对培养的海马神经元中致密核心囊泡进行成像的实验步骤。首先通过混合DNA-MEM培养基与脂质体转染试剂获得转染复合物。

由于海马神经元培养在倒置的盖玻片上，并面向胶质细胞单层，因此必须将这些盖玻片翻转，以使其暴露于转染试剂中。在给予足够时间使GFP标签致密核心囊泡蛋白充分表达后，构建成像室。可利用宽场荧光显微镜对培养神经元中的致密核心ICAls进行成像。

该方案具有灵活性，可进行调整以对其他细胞器（如线粒体、内体和过氧化物酶体）进行成像。大家好，我是迈克尔·西尔弗曼（Michael Silverman），欢迎来到我在西蒙弗雷泽大学的细胞神经科学实验室。我们致力于研究细胞器在神经元中的运动方式。

为了回答这一问题，我们对培养的海马神经元中的膜性细胞器，特别是致密核心囊泡进行标记。为了向您展示我们的操作方法，接下来我将把讲解交给 David。大家好，我是来自 Silverman 实验室的 David。

今天，我将向您展示一种利用宽场荧光显微镜对致密核心囊泡和培养神经元进行活细胞成像的实验方法。让我们开始吧。在大多数实验中，我们使用培养于6厘米培养皿中的大鼠海马神经元，每个培养皿的细胞密度为250,000个细胞。每次转染需标记两个1.5毫升离心管，一个用于质粒DNA，另一个用于转染试剂。

在超净工作台中，于室温下将一微克质粒 DNA 与一百微升不含任何添加剂的 MEM 培养基加入同一根离心管中。在另一根离心管中，将六微升脂质体试剂与一百微升 MEM 培养基混合。即使在此情况下脂质体与 DNA 的比例将减半，该用量也可用于双重转染。

为了保持脂质试剂的保质期，应始终将其冷藏或置于台式冷却器中，并将离心管在室温下孵育5分钟。将MEM中的DNA混合物转移至脂质管中，轻轻混匀后用APE Next继续在室温下孵育30分钟。在25分钟后，加入60微升50毫摩尔的K神经氨酸以尽量减少对培养神经元的细胞毒性损伤。

由于我们将神经元培养在悬浮于GL单层上方的盖玻片底面，因此需要将盖玻片翻转，使神经元暴露于转染溶液中。使用无菌镊子小心地将盖玻片翻转，使“脚部”朝上。摆放时确保它们不相互重叠。

注意不要刮擦盖玻片上涂有神经元的表面或培养皿上涂有ggl的表面。30分钟孵育结束后，从六厘米培养皿中取出约N 0.5毫升培养基，轻轻与试管中的DNA混合。将DNA溶液转移回培养皿中，均匀滴加到培养基表面。

将培养皿沿一个方向轻轻前后滑动，注意不要使培养基产生气泡。在一个方向混匀后，停止操作，再沿垂直方向重复进行，以使DNA转染复合物均匀分布于整个培养皿中。随后在37°C、5%二氧化碳的组织培养孵箱中孵育90分钟。

孵育后，将盖玻片翻转至底部朝下，并排列成互不重叠的状态。最后，在培养箱中让DNA表达进行所需的时间，通常为过夜至48小时。对培养的海马神经元中GFP标记的致密核心囊泡进行活体成像时，需要配备CCD相机的荧光显微镜。

需要一个带有温度控制器和物镜加热器的成像腔室。该腔室应无开放端口，此项改装可在订购腔室时一并提出。接下来，启动显微镜相机、荧光灯和图像采集软件。

打开腔室载物台和物镜加热器的电源。此时也可在物镜上滴加一滴镜油。现在准备加热载物台和成像腔室。

为便于操作，使用永久性标记笔在培养室盖的一侧做好标记。将培养室盖有标记的一面朝上，放置在50毫升离心管的管盖上，该管盖是理想的培养室支撑架。

将一环润滑脂涂抹在标记为“top”的腔室侧面孔洞周围的凹槽中。避免过量使用润滑脂，因为它会进入腔室并减少可观测区域。使用镊子操作。

将一块洁净且未使用过的18厘米盖玻片贴附到腔室的顶面。轻轻按压盖玻片边缘，使其在腔室的凹槽内形成紧密密封。将腔室翻转，然后在相对的另一面或底面的凹槽上涂抹类似的一圈润滑脂。

将750 µL成像培养基转移至腔室中。此体积略多，但封口脂可防止培养基溢出，多余的培养基还能在放置带有细胞的盖玻片时避免产生气泡。将制备好的腔室置于组织培养孵箱中备用。

应避免长时间孵育（例如一小时或更长时间），因为成像介质会蒸发并发生成分改变。对于用于生命过程成像的最终腔室组装，将已准备好的腔室和一皿转染后的盖玻片从培养箱转移至组织培养操作台。使用无菌镊子，小心地从转染后的培养皿中取出一张盖玻片。

然后用盖玻片的一边接触无尘纸，以吸走培养基。接着将盖玻片有神经元的一面朝下放入已准备好的腔室中。先将盖玻片的一侧接触封固油脂，然后沿边缘施加压力，使盖玻片平整贴合，避免产生气泡。

多余的成像介质会溢出，用纸巾擦去多余的成像介质，但注意不要移动盖玻片的位置。将培养腔转移至预热的平台加热器上，并固定培养腔。随后，将培养腔转移至显微镜载物台上，以减少光漂白和光毒性。

调整光源至能够找到转染细胞所需的最低强度。现在寻找目标细胞。使用低倍油镜（如 40 x），建议遵循预先规划的搜索模式，以确保盖玻片区域的最大覆盖，并避免重复采集图像。

找到目标区域后，切换至目标荧光标记蛋白的通道。使用高倍油镜物镜（例如 60 至 100 倍），并将光源强度调回高亮度设置，利用成像软件的实时采集功能或类似功能记录快速移动细胞器中荧光标记蛋白的动态变化。应尽量缩短每次曝光的时间以及曝光间隔，以获得高帧率的录像。

在屏幕预览中观察到的焦点漂移可通过手动调焦实时校正。务必拍摄相差图像以及后续分析和展示所需的其他所有图像。在进一步观察盖玻片并进行下一次记录之前，保存所有图像。

通常，从一张盖玻片获得三到五次记录即视为成功，每张盖玻片成像时间为30至60分钟，需始终关注光毒性对细胞总体健康的影响，因为受损细胞中的转运蛋白功能会下降。活细胞成像观察通常由一系列图像记录（也称为图像层叠）组成，用以显示视野内荧光标记细胞器的运动情况。以下是一段致密核心iCal转运的代表性视频。

颜色已反转，以便更清晰地观察。请注意移动的颗粒。CH 图是通过并列线扫描来展示颗粒运动的图像，其中每个时间点在图中以一列形式表示。

该图展示了在CH图中如何表示沿相反方向运动的两个颗粒。对计时图的进一步分析可以提供有关颗粒流速、运行长度反转以及静止颗粒的信息。您好，我们刚刚向您展示了如何对培养的海马神经元中dsco囊泡运输进行高速记录。

进行此操作时，重要的是要记住预先加热成像室和载物台的所有组件，以减少细胞从培养箱转移到显微镜载物台过程中所受到的应激。操作时应迅速但谨慎。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。