实时成像 黑腹果蝇 荧光染料标记的胶质细胞-神经肌肉接头

该实验首先制备果蝇幼虫，将其翻转使体壁肌肉细胞表面相关的运动神经元和胶质细胞暴露出来，结合对突触前神经元末梢的荧光染色、胶质细胞和突触后肌肉细胞膜上靶向表达的GFP与DS red的内源性表达，以及利用荧光染料对突触旁间隙进行成像，可在活体样本中清晰观察到胶质神经肌肉接头处发生的结构变化。大家好，我是不列颠哥伦比亚大学动物学系Vanessa渐冻症实验室的D Brink。今天我将向大家展示一种组织制备方法及两种细胞标记技术，用于活体果蝇三龄幼虫组织的共聚焦显微镜成像。

我们在实验室中采用此方法研究神经肌肉突触处的胶质细胞。现在，让我们来介绍一种完全不同的方法：从内到外的组织制备始于幼虫的分期。本方案将以游走期三龄幼虫为例进行演示，因为它们体型较大且易于解剖，仅使用那些正在活跃爬行的三龄幼虫。

接下来，用非常柔软的画笔在盛有双蒸水的培养皿中清洁幼虫表面。清洁幼虫非常重要，因为这可以改善光学效果，同时减少细菌。幼虫清洁后，将其转移至含有3 mL冰冻HL6溶液（含5 mmol/L谷氨酸）的小培养皿中。

将培养皿置于冰上，直至动物停止活动并完全放松，通常需要约两分钟。一旦幼虫停止运动，即可开始组织解剖：用惯用手持弹簧剪，另一只手持超细尖镊子，在解剖显微镜下操作。用另一只手用剪刀在体壁上剪出一个小孔，以平衡体壁两侧的压力，同时轻轻将动物固定在培养皿底部。

用镊子剪除后部两个体节，并解剖去除内脏。一些脂肪体可能会通过切口从体腔中移出，也将这些组织一并剪除。

继续用精细镊子轻轻将幼虫固定在培养皿底部。另一只手握住一根钝头0号昆虫针，将其抵住幼虫的口器部位，并将口器推入体腔，如同将袜子翻面时套在拳头上的动作。

组织的内面朝外时应呈现如此形态。使用超精细解剖弹簧剪，将体壁上的脂肪体和气管剥离并清除。尽可能多地去除脂肪体。

务必小心，避免牵拉气管或损伤神经系统。撕裂气管会同时在体壁肌肉上造成破孔。完成解剖后，肌肉应呈半透明且松弛状态，而非不透明或收缩状态。

如果将肌肉置于室温下不含谷氨酸的 HL6 溶液中，它很可能会发生节律性收缩。由于中枢神经系统中的运动模式发生器具有活性，完整翻转的体壁倾向于沿背侧和腹侧中线对折，因此该制备标本可呈现左侧或右侧的半体动物形态以供观察。

最后，使用桥式盖玻片装置将组织封片于显微镜载玻片上。组织封片的具体步骤将在后续展示。开始标记神经元棒状突起时，用移液器吸取30 µL荧光标记的一抗HRP抗体溶液（溶于HL6中），滴加一滴至培养皿上。

接下来，将翻转的体壁制备物浸入染色液中。约五分钟后可观察到神经元末端的标记，但为了获得完整且明亮的标记，建议孵育10至20分钟。

为洗去多余的 HRP 标记物，将组织置于 0.5 毫升 HL 六溶液中，在室温下孵育 10 至 30 秒。未结合的染料可迅速被洗脱，因此清洗步骤无需过长时间或剧烈操作。标记后的组织现已准备好进行封片，并通过显微镜观察。

对刚刚展示的活体抗体标记方案的一种改进是使用荧光标记的葡聚糖来突出显示充满液体的细胞外空间。开始该实验时，将荧光标记的葡聚糖染料用 HL6 缓冲液稀释至 0.001 毫克/毫升。如果你不关注葡聚糖进入细胞外空间的确切时间，则可能需要调整葡聚糖的浓度。

用移液器吸取20微升染料滴加到桥式盖玻片上，然后将组织样本转移至染料液滴中。如果无需灌流内翻的组织，或需保持HL六溶液的体积较小，则可将其安装在双桥式载玻片上。首先，用强力胶将两片18毫米的方形盖玻片粘在非常洁净的显微镜载玻片上。

在盖玻片边缘之间留出两毫米的间隙，并将该间隙大致置于载玻片中央。让胶水完全干燥，否则会在组织样本周围的水相介质上形成一层膜。

接下来，在盖玻片之间的缝隙中加入30微升HL六溶液。将内外翻转的组织置于HL六液滴中。如果幼虫较大且成像系统像素阵列有限，可能需要将组织以对角方向放置。

取少量凡士林涂抹在第三片18毫米盖玻片的边缘，将涂有凡士林的一面朝下，轻轻压在已用胶固定的两片盖玻片上，覆盖于组织之上。以下是使用转盘共聚焦显微镜获得的两种急性荧光标记方法对翻转幼虫制备样本的成像结果。第一幅图是胶质细胞-神经-肌肉突触的光学切片层析图像，其中活体抗HRP标记了布顿（Buton）末梢。

在肌细胞表面，我们可以看到被强烈标记的神经元钮状终末，以蓝色伪彩显示。在图像堆栈的中部，可见绿色标记的GFP阳性胶质细胞突起，以及蓝色HRP标记的钮状结构。围绕这些钮状结构，可以看到类似袋状的突触后网状结构（SSR）的横切面，即突触下网状结构，在堆栈中层和深层还可见DS红色标记的SSR，呈红色。

SSR 是肌细胞中的特化突触区域。BNS 嵌入肌细胞的凹陷内，部分绿色胶质细胞突起也位于这些凹陷中。胶质细胞突起环绕在 BNS 和 SSR 周围，但在图像堆栈的最深层，并不会像毯子一样完全覆盖突触表面。

我们观察到绿色的胶质细胞突起和红色的突触后致密区（SSR），但突触小结的数量较少。我们还可以找到支配肌肉的运动神经的横切面。胶质细胞包裹着运动神经，因此运动神经也呈绿色。

急性荧光标记内外翻幼虫制备物的第二个结果是荧光葡聚糖标记的突触。在此，突触间隙或突触裂隙中的液体被标记为红色。在光学切片图像的表面层，可见一层红色葡聚糖染料的液体，可观察到其在肌细胞膜的波纹状凹陷处聚集。

在图像堆栈的深层，荧光葡聚糖染料已渗入突触间隙，在神经元末端与蓝色标记的 SSR 小囊之间形成微小的环状染料池。这是被染料标记出的突触间隙。绿色的胶质细胞片层并未阻挡染料在图像堆栈深层渗入突触间隙。

最显著的特征是肌肉中被标记为蓝色的SSR或突触区域，以及呈绿色的扁平胶质细胞突起。同样，在深层可见的神经轴突周围的胶质鞘也呈绿色。该胶质鞘似乎排除了葡聚糖染料的进入。

我刚刚向您展示了一种在果蝇幼虫的外翻组织制备样本中可视化胶质神经肌肉突触的新方法。在制备组织时，务必注意轻柔操作，确保肌肉处于松弛状态，并避免损伤周围神经。最后，我想引用马克思的一句话作为结束。

光阴似箭。恐惧则如香蕉般飞逝。