解剖并记录秀丽隐杆线虫神经肌肉接头

将一滴琼脂糖涂在盖玻片上，过夜固化后制成琼脂糖包被的盖玻片，将其放入预制记录室的圆形腔室中，并用记录液覆盖。将一条线虫置于中央，使用胶水移液管将胶水涂抹在线虫背侧，从头部或尾部开始，将其粘附于挡板表面。胶合完成后，用玻璃针在阴门附近、角质层与胶水交界处做一切口，并向头部方向延伸，同时将体腔内的内脏和卵取出。

用胶水将切口的切缘点焊到sohar上，暴露腹神经和体壁肌肉。将记录电极置于阴门前方的腹侧中线肌肉进行膜片钳记录，刺激电极则放置在神经索的上游位置。您好，我是珍妮特·里士满（Janet Richmond），芝加哥伊利诺伊大学生物科学系的副教授。

今天我将向您展示一种解剖技术，该技术可暴露海兔的神经肌肉接头，用于进行电生理记录。我们利用这种制备方法来研究突触传递。

好的，我们开始吧。在处理线虫之前，必须至少提前一天制备一些实验器具，包括解剖记录小室、S型保护涂层玻璃盖玻片、旧移液器、胶水涂抹器以及提取用移液器。

首先构建实验腔室。将一块厚度为1/16英寸的有机玻璃板切割成与显微镜载物台相匹配的尺寸，并用于在有机玻璃中心区域进行记录。

钻出一个足够大的圆形孔，以容纳直径为22毫米的圆形盖玻片胶。使用低熔点石蜡颗粒，将一块48 × 60毫米的盖玻片固定在孔下方腔室的底面，每个角落各放一粒石蜡。将石蜡在加热板上迅速熔化，冷却后在有机玻璃与盖玻片之间形成一层薄薄的蜡层，用刀片修去多余的蜡。

适用于该腔室的盖玻片为22毫米S型防护涂层盖玻片。SARD试剂必须按照制造商说明新鲜配制才能发挥作用。配制完成后，将少量SARD试剂滴加至每片盖玻片上，并用刀片涂抹，以形成均匀的表面。

将包被的盖玻片放入带盖容器中，置于65摄氏度烘箱内过夜固化。次日即可用于整个实验流程中的解剖操作。需要外径为1毫米的硅酸盐玻璃移液管，拉制后尖端电阻约为4兆欧，因此建议准备一个容器专门存放。

参见 Miriam Goodman 使用可编程拉制仪制作用于乔氏出版物的膜片、移液管和尖电极的视频。进行电生理实验的技术细节要求将线虫固定在位，为此需要使用胶水涂抹装置。

胶水涂抹器就是一个长2毫米、内径1毫米的塑料管。将塑料管的一端含在口中，可加装吹嘴，另一端则插入一支装有胶水的1毫米移液管。

解剖过程中还需使用一种特制的提取移液管。这种移液管由管体和移液头组成，与胶水涂抹器类似，但移液头的尖端稍作回折，以便容纳卵和内脏组织。首先，在腔室的边缘绘制一条蜡线。

现在按压并放置一片S型保护涂层的盖玻片，使Sylgard面朝上。蜡线可固定盖玻片，防止灌流液在解剖和记录过程中渗入盖玻片下方而导致其移位。随后，向记录 chamber 中加入细胞外记录液。请阅读随附文本以了解配制方法及 chamber 的准备步骤。

使用线虫挑针将数条线虫放入溶液中。经过练习，可以在不采取额外固定措施的情况下，将游动的线虫粘附固定。准备一个由固定在石蜡或油灰中的PCR管盖制成的胶水容器，并加入Sano丙烯酸胶工作液，以便操作使用。

通过将记录移液管连接到胶水施加器的末端，完成胶水施加器的组装。然后在解剖显微镜下，用口吸法将胶水施加器充满胶水。由于胶水在接触细胞外记录溶液时会立即发生聚合，因此将其粘附到线虫上具有较大难度，需要反复练习。

为解决此问题，应保持胶水持续向外流动，否则胶水会硬化并堵塞移液器。若移液器已被堵塞，可尝试轻轻敲击其尖端于盖玻片上以解除堵塞。练习操作胶水的使用。

当你能够用胶水在硅胶垫片上写出自己的名字时，你可能就已经准备好将线虫体壁粘附到硅胶垫片上来固定线虫了。首先，选择一个位于腔室中央附近的线虫，确保周围有足够的操作空间。其次，取少量胶水粘附在线虫的头部或尾部，然后迅速将线虫拉下，使其紧贴硅胶垫片表面。

然后沿着线虫角质层的背侧边缘涂抹一条胶水。这会迫使线虫呈C形弯曲，使阴门朝向内侧。为实现线虫与载物台之间最大程度的粘附，胶水线中的任何间隙都应补满。

这是一个较为复杂的过程，建议先在运动迟缓突变体上进行练习。比如在31号位置，其右侧有一个明显的膨大结构。现在我将调整样本的位置，然后引入玻璃针并开始进行切口操作。要切割角质层时，需切换至手持式解剖移液器。

该移液管需要比用于记录胶质的移液管更锋利，并在最高放大倍数下使用短而坚固的杆部。在解剖显微镜下，将移液管与线虫的纵轴平行对齐，并将尖端插入靠近阴门处的角质层与胶质交界处。此切口可释放线虫的静水压力，迫使卵和肠道内容物从切口处排出。

继续以类似拆信件的切片动作，沿线虫体壁向头部方向切割角质层，直至到达咽部。随后换用提取移液管，吸出线虫的内部器官。在清除切口后，打开的角质层将保持其圆柱形结构。

接下来，取一支新的粘合移液枪。用它将切口边缘的角质层在硅胶保护层表面进行点焊固定。此步骤中应尽量使用少量胶点，以避免损伤或遮挡 njs。

腹神经索和体壁肌肉现已暴露，但仍需去除覆盖在神经肌肉接头上的基底膜。为此，先从记录室中吸除细胞外记录液，然后加入含有0.4毫克/毫升胶原酶的细胞外记录液。10至20秒后，吸除胶原酶，并用新鲜的记录液多次冲洗标本。

线虫现已准备好进行电生理记录。将线虫置于直立显微镜载物台上的记录室中，先使用10倍物镜将线虫居中，然后切换至40倍水浸物镜并配合微分干涉差（DIC）光学系统，检查体壁肌肉和神经索是否完整。将线虫水平放置，以便电极可以从左侧和右侧同时引入。

通常，我们对腹侧中体进行膜片钳记录，该区域位于阴道内侧肌肉处，但线虫背侧和腹侧的肌肉均可轻松进行膜片钳记录，且可见数个神经元呈半圆形紧贴肌肉。现在使用标准的膜片钳技术对肌肉进行钳制，以获得吉欧姆（gigaseal）密封。根据我们的经验，在全细胞电压钳记录模式下，使用电阻约为4兆欧的记录电极效果良好。

增加负压并击穿膜片，直到 gigaseal 被破坏。我们之前提到要形成约四兆欧的电阻，因此如果你观察此处，是的，这里显示为 4.9 兆欧。

它更大，属于正常范围。在我们常用的合理范围内。好的。是的。现在我们要尝试加大，那么接下来怎么做？

什么？我们希望它能完全降下来。好的，明白了。太好了。

在良好的记录条件下，野生型成年线虫的体壁肌肉细胞膜电容通常约为70皮法，并可在-60毫伏的钳制电位下稳定记录至少10分钟，且钳制电流极小，约为50皮安。一旦对肌肉细胞形成膜封，通过第二个电极刺激、光激活通道（如Rodin）或加入高渗溶液，均可产生可测量的反应。为了诱发电刺激引起的反应，我们通常将含有细胞外溶液的刺激电极放置在 patched 肌肉内侧的腹神经索上。

这种松散封接构型需要持续一到两毫秒、电压在10至40伏之间的电流脉冲。然而，经过几次诱发电位后，神经索会不可逆地受损，且出于未知原因，仅能通过该构型诱发出胆碱能反应。另一种方法是使用表达光敏通道的线虫，通过在不同神经元群体中表达dosin转基因，可用来诱发释放。

在准备本方法时，需注意用于此应用的线虫必须在添加了视黄醇的细菌上培养。在此制备过程中，使用高功率470纳米LED光源，并通过GFP激发滤光片（450至490纳米）过滤，以反复激活通道视紫红质，从而诱导不同神经递质的释放，具体释放的神经递质取决于表达该通道的细胞类型。最后一种技术可用于测量多个神经元突触囊泡的可立即释放池的大小，这些囊泡释放作用于被记录的肌肉细胞。

这是通过将高渗细胞外溶液以压力脉冲方式作用于贴附的肌肉上持续一到三秒来实现的。结果将产生一系列异步的突触后事件。上述三种刺激方案——电刺激诱发、光刺激诱发以及高渗溶液诱发反应——的全细胞电压钳制体壁肌记录结果均已在图中展示。

在所有情况下，腹侧中段体壁肌均被钳制在负60毫伏。野生型肌细胞通常表现出较高的内源性内向微型突触电流频率。在我们的标准记录溶液中，前腹神经索的2毫秒去极化可引起多个突触的同步释放，从而产生约2至2.5纳安的大幅度诱发电流反应。

在野生型蠕虫中，A和B图右侧的代表性轨迹显示了严重运动失调突变体中的突触释放。图C显示了表达通道红视紫红质的野生型蠕虫神经肌肉接头处的光诱发反应。在胆碱能神经元中，持续两毫秒的光脉冲通常产生1.5至1.8纳安的反应。对肌肉施加850毫渗的高渗盐水，持续一秒钟，可引发异步的微型突触电流爆发，代表囊泡的易释放池。

我刚刚向您展示了我们用于暴露海兔神经肌肉接头并进行电生理记录的解剖技术。需要记住的是，这项技术具有挑战性，您可能需要数月时间才能掌握。然而，一旦掌握，就如同骑自行车一样熟练自如。

这些技术将伴随您，您练习得越多，制备过程就会变得越快、越可靠。就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。