可视化抗原特异性CD4 + T细胞的MHC II类四聚四

Teer检测的独特之处在于它能直接观察抗原特异性T细胞。te，也就是teer，是我们检测中最独特的方面。这还配合我们所做的放大步骤。

你知道，我们先分离出T细胞，然后在一个能富集我们感兴趣的T细胞样本的环境中培养它们。然后，我们能够专门标记这些细胞，并在流式细胞仪上观察它们。而以往的检测方法，比如几十年来存在的CSFE或增殖检测，你得到的其实是整体T细胞群体的整体测量。

但你体内有数百万个T细胞，它们能看到一整套多样的模式。如果幸运的话，样本中每两到三十万个细胞中，可能只有一细胞是你正在观察的那个。这就是为什么这个检测方法会做浓缩步骤。

然后通过检测数值，因为你是直接染色，实际上可以从背景中看到一个细胞总数不到1%的群体。所以你可以看到非常非常细微的差异，并且可以相当精确地统计血液样本中识别你感兴趣模式的个体中的T细胞数量。但这还不止于此，因为这些Teter不仅可以标记这些T细胞，还能分离出来进行进一步分析。

你们用的这些Teters其实是在BRI本地制造的，对吗？是的。我们是全国极少数成功实现二级级的实验室之一。我们的目标是以成本分发这些试剂给有意进口该技术的任何实验室。

你认为在其他实验室复制该检测过程中，最困难或最具挑战性的方面是什么？仔细想想，其实有两个原因，T细胞的生长。这真的是一种艺术。

你几乎每天都需要决定细胞是否需要额外的养分或更多生长空间。然后，我认为对没有经验作的人来说，最难的部分其实是数据分析。就是要弄清楚信号中哪部分是真正的积极反应，哪些只是物理和吸引力固有的。

而且每件事都带有一定程度的粘性，这同样需要大量经验，尤其是在整体反应较弱的语境下。你通过这个检测获得的信息目前有何潜力对患者有益？任何自身免疫患者最先出现的特征之一，就是一组针对该疾病的抗体。

我们从免疫学的基本原理知道，只要有抗体反应，T细胞总是先有反应。如果我们能观察高风险个体，看到抗体形成前T细胞活性的跳升，这将有助于我们定义一个全新的风险水平，即个体正朝着自身抗体的方向发展，希望这为介入疗法打开窗口。该程序将纯化并扩增抗原特异性CD四个阳性T细胞，并利用三级试剂和设备二级层流生物安全柜进行可视化。

这将是手术的主要工作空间。50毫升锥形管，PBMC隔离用主管，一XPBS。这应该是无钙镁的Fol包，外包铝箔以防轻质移液管，CoStar 10密尔移液管气雾罐，带有50密尔插入件，用于防止离心机血液污染。

GS六R离心转移移液器，巴斯德移液器含8.3克/升溶血缓冲液。氯化铵1.0克/升。碳酸氢钠0.04克/升，去钠EDTA，三蓝0.2%溶液，置于PBS血氧细胞仪15毫升锥形管缓冲液中，含PBS，辅以2毫莫尔EDTA及5克/升。

BSA Max CD四级隔离套件，二套从Milin生物技术购买的EP磁块，来自干细胞技术。其他磁性电池浓缩平台同样可有效使用。5毫升聚丙烯管RPMI 1640，辅以25毫莫拉的嬉皮士，用于制作T细胞培养基，混合人类血清，用于补充T细胞培养基，500毫升，0.22微米瓶顶滤，无菌48孔板，用于体外扩殖培养，步骤37度二氧化碳培养箱，含目标表位的合成肽溶液20毫克/毫升。

5毫升聚苯乙烯传真管肽装载2类TEER，用于观察抗原特异性T细胞、抗CD3、抗CD4和抗CD-25抗体，这些抗体用于包裹抗原特异性T细胞。开始手术前请传真口径流细胞仪或同等设备。在工作区内组装所有材料和设备。

以下演示将涵盖以下步骤。PBMC分离，CD4阳性T细胞分离，体外扩增培养通过teem或染色可视化T细胞。第一步PBMC隔离。

采集血液样本。血液应用注射器或输血管收集，并以1比50的比例用肝素抗凝以防止血栓形成，预计每毫升血液产出约100万PBMC。其中约40%是CD中4个阳性T细胞。

把血液分成50毫升的锥形管。每管输血25毫升。在ALI凝血前轻轻混合血液以分散血浆。

加入PBS，使总体积达到40毫升，并通过干燥11毫升纤维素插入输液管，并小心取出移液器辅助物，进行底层叠加。纤维会慢慢排入管底。液位平衡后，缓慢将移液管从输液管中取出，盖上盖子，然后进入气溶胶罐中。

牢牢关闭罐子，离心机以900倍G速度离心20分钟，不间断。关键是，在自旋结束时不能施加断裂，因为断裂力会扰动自旋后的细胞层。PBMC应在上方黄色等离子体和下方透明纤维之间形成一层明显的白色层。

用转移移液器轻轻撇除白细胞层，然后转移到新的管子。部分血浆和菲亚尔可以用PBMC提取，但避免提取任何红细胞层。通常在此阶段可以将两根血管合并成一个细胞管。

要增加沉淀体积，加入PBS，使总体积达到15毫升，并在500倍G下以低断裂离心15分钟，气溶胶罐用糊状移液器吸入液体，注意不扰动沉淀。用溶血缓冲液处理，每管加入5到6毫升，轻轻搅拌以去除结块。潜伏时间不超过五分钟。

加入PBS，使总体积达到50毫升，并以230乘G离心机离心10分钟。在低断速旋转时，气溶胶罐不再需要用于这些较慢的旋转。在最后清洗步骤前，用装有PBS的牧场移液管和离心机在230倍G下洗涤两次，吸取液体10分钟，取出一部分悬浮细胞，用三蓝稀释，并用血细胞计数仪计数。

该细胞计数决定了T细胞分离中使用的试剂体积。第二步，CD-4正向T细胞分离，抽取液体并添加缓冲液，使总体积达到每1000万细胞40微升。通常需要30微升缓冲液加上残留颗粒体积。

将这个体积转移到一个15毫升的锥形管上。加入CD中的抗体混合物，四个分离套件，每1000万细胞10微升，封闭管，冰敷10分钟。取出冰管，取下盖子，每1000万细胞添加30微升的缓冲液。

从CD4隔离套件中添加磁珠。每1000万细胞20微升，放入盖管，冰敷15分钟。加入10体积的运行缓冲液，以230倍G的压力冲洗并离心10分钟。

脱水时，在工作区安装磁铁和5毫升聚丙烯管。从细胞颗粒中吸入液体。加入两毫升流动缓冲液，用转移移液器去除结块。

使用相同的移液器移液槽，放入5毫升管中，并在磁铁中孵育15分钟。小心地将CD四正T细胞分数倒入标记的15密耳管中，方法是反转磁体并清空除最后一滴。再往5毫升管中加入两毫升缓冲液，然后从磁铁中取出。

轻轻冲洗CD管侧面的四个负细胞，转移到标记为15密耳的管子中。每管加入2毫升T细胞培养基。取出分量样品进行细胞计数，并以230倍G离心10分钟。

用三蓝稀释细胞分液，并用血细胞计数仪进行计数。这些细胞计数将决定用于扩增培养的孔数。第三步。

体外扩殖培养，根据细胞计数从CD4阳性和阴性细胞颗粒中抽吸液体。向CD中添加四个正电池，将容量调整为每密耳300万个细胞。在CD中添加四个负细胞，将容量调整为每密耳1000万个细胞。

扩殖培养每孔需300万个CD和4个阴性细胞，每孔需200万至300万个CD4个阳性细胞。通常，CD4阳性细胞是限制性群体。将四个负细胞分割到48孔板上相应数量的孔中。

每颗中加入300微升，将平板放入37度的培养箱中一小时。取出培养板、培养箱，通过添加500微升新鲜培养基清洗孔，并用转移移液器轻轻上下移液12到20次，将所有液体清除。这种洗涤会留下一层粘附的抗原呈递细胞。

洗涤完成后，加入刚好足够润湿底部的介质，大约100微升。否则A附着细胞会干燥。如有需要，每孔加200万到300万个CD和四个阳性细胞。

添加额外介质，使每个油井的总体积达到一毫升。每件都加入所需的肽。井。典型的刺激浓度为每毫升10微克。

最终置盘放在37度的孵化器中，放置7天。七天后。之后的每一天，每孔各加2微升血红素IL。

使用显微镜监测尚未汇合的供料孔细胞生长，方法是移除一半培养基，添加新鲜培养基和50微升IL两个分流孔，通过呼救术将细胞移至空孔。加入新鲜培养基和50微升IL回归细胞到孵育箱。膨胀细胞在培养13至15天后即可进行TEER染色。

第四步，通过Teer染色可视化T细胞，购买或组装Teter以匹配肽。MHC组合用于刺激CD中四个阳性T细胞。将培养皿从孵化器中取出。

谨慎地从每个项目中提取一半的媒体内容。从每个孔中转移一批细胞，通常为75微升或约50,000个细胞，进入5毫升聚苯乙烯传真管，加入每50微升总体积1微升的液体，放入37度培养箱中一小时。还建议用不匹配的TEER对每个孔的第二个分量，作为阴性对照标记细胞，并用抗CD3、抗CD4和抗CD 25抗体染色。

还可以使用额外的或替代抗体标志物。但不要使用PE标记抗体，因为此时该通道必须保留给teem。另外，用额外的单元格标记任何单色或同型控制。

将抗体标记的细胞在四度下培养15到30分钟。用0.5到1毫升的缓冲液清洗每根管子，并以230倍G离心机清洗10分钟。仔细从传真管中倒出液体，使用参考珠、单色控制管、等型控制等对流细胞仪进行校准。

用流式细胞仪分析每根管子。四元素阳性细胞应是扩展后的CD四个阳性T细胞中的一个独立群体。四特拉阳性细胞通常为CD25阳性，且常为CD4高。