Name: 可视化抗原特异性CD4 + T细胞的MHC II类四聚四 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: 学习使用MHC II类四聚体技术从外周血中纯化并体外扩增抗原特异性CD4+ T细胞，通过流式细胞术直接可视化目标细胞群体。该方法可精确识别和计数特异性T细胞，为免疫学研究提供高灵敏度检测手段。

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感谢 Dick Foley 和 Leigh Kimball 在拍摄和视频制作中的关键贡献。

1. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离
<ol>
	<li>采集血样——应使用注射器或采血管收集血液，并以肝素（1:50 比例）抗凝，防止血液凝固。预计每毫升血液可获得约 1×106 个外周血单个核细胞（PBMC），其中约 40% 为 CD4 阳性（CD4+）T 细胞。</li>
	<li>将血液分装至 50 mL 圆锥形离心管中，每管 25 mL。若血液已发生分层，分装前应轻柔混匀，以均匀分布血浆。</li>
	<li>加入 PBS，使总体积达到 40 mL，然后通过吸取 11 mL Ficoll，插入血样管中，小心将移液器辅助装置从移液管上取下，使 Ficoll 缓慢流入管底。待液面平衡后，缓慢将移液管从血样管中取出并弃去。</li>
	<li>盖紧血样管，放入 Aerosolve 离心罐中。牢固封闭离心罐，以 900×g 离心 20 分钟——不使用刹车。此步骤结束时严禁使用刹车，因为制动力会扰动细胞分层。</li>
	<li>离心后，PBMC 应在上层黄色血浆与下层透明 Ficoll 之间形成明显的白色层。使用转移移液管轻柔吸取白细胞层，并转移至新管中。PBMC 中可能混入少量血浆和 Ficoll，但应避免吸取红细胞层。通常在此步骤可将两管血液样本合并至同一细胞管中，以增大沉淀体积。</li>
	<li>加入 PBS，使总体积达到 50 mL，以 500×g 离心 15 分钟——在 Aerosolve 离心罐中使用低刹车。</li>
	<li>使用巴斯德移液管吸除上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>加入 5–6 mL 溶血缓冲液处理各管，轻柔混匀以去除团块，孵育时间不超过 5 分钟。</li>
	<li>加入 PBS，使总体积达到 50 mL，以 230×g 离心 10 分钟——使用低刹车。此后较低速度的离心不再需要 Aerosolve 离心罐。</li>
	<li>洗涤两次：使用巴斯德移液管吸除上清液，用 PBS 重新充满离心管，以 230×g 离心 10 分钟。</li>
	<li>在最后一次洗涤步骤前，取一部分重悬的细胞，用台盼蓝稀释后，使用血细胞计数板进行计数。该细胞计数将决定后续 T 细胞分离步骤中所用试剂的体积。</li>
</ol>
2. CD4+ T 细胞分离*
<ol>
	<li>吸去液体，加入洗脱缓冲液，使每1000万细胞的总体积达到40 µL。通常需要加入30 µL缓冲液以及残留的沉淀体积。</li>
	<li>将此体积转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>加入CD4分离试剂盒中的抗体混合物——每1000万细胞加入10 µL，盖紧管盖，并置于冰上孵育10分钟。</li>
	<li>从冰上取出管子，打开管盖，每1000万细胞加入30 µL洗脱缓冲液。</li>
	<li>加入CD4分离试剂盒中的磁珠——每1000万细胞加入20 µL，盖紧管盖，并置于冰上孵育15分钟。</li>
	<li>加入10倍体积的洗脱缓冲液进行洗涤，并在230×g下离心10分钟。</li>
	<li>在离心过程中，在工作区设置好磁力架和5 mL聚丙烯管。</li>
	<li>吸去细胞沉淀中的液体，加入2 mL洗脱缓冲液，使用移液器去除团块。</li>
	<li>使用同一移液器将细胞转移至5 mL管中，并放入磁力架中孵育15分钟。</li>
	<li>小心地将CD4+细胞组分倒入已标记的15 mL管中：翻转磁力架，倒出液体，仅保留最后一滴。</li>
	<li>向5 mL管中再加入2 mL洗脱缓冲液，然后从磁力架上取下。</li>
	<li>轻轻冲洗管壁上的CD4-细胞，并将其转移至另一个已标记的15 mL管中。</li>
	<li>向每根管中加入2 mL T细胞培养基，取出部分细胞用于计数，并在230×g下离心10分钟。</li>
	<li>用台盼蓝稀释细胞样品，使用血细胞计数板进行计数。这些细胞计数结果将决定扩增培养步骤所需的孔数。</li>
</ol>
* 或者，可根据生产商说明书，使用 MACS 柱和磁珠（Miltenyi Biotec）、AutoMACS 细胞分选仪（Miltenyi Biotec）或 Robosep 细胞分选仪（Stem Cell Technologies）替代步骤 2.2 – 2.11。
3. 体外扩增培养
<ol>
	<li>吸弃 CD4+ 和 CD4- 细胞沉淀中的液体，并根据细胞计数结果加入培养基（通常每毫升含 300 万 CD4+ 细胞和 1000 万 CD4- 细胞的浓度适合建立培养体系）。扩增培养需在 48 孔板的每个孔中加入 300–500 万个 CD4- 细胞和 200–300 万个 CD4+ 细胞，总体积为 1 mL 培养基。通常情况下，CD4+ 细胞是限制性细胞群。</li>
	<li>如需要，对 CD4- 细胞进行照射处理（5000 Rads）。将 CD4- 细胞分装至 48 孔板的相应孔中，每孔加入 300–500 μL。将培养板置于 37°C 培养箱中孵育 1 小时。贴壁的 CD4- 细胞将在扩增培养中作为抗原呈递细胞。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板。</li>
	<li>通过移液管向每孔加入 500 μL 新鲜培养基，并使用移液管轻柔吹打 12–20 次，随后完全吸弃液体，完成洗涤步骤。此洗涤过程将在孔底留下一层贴壁的抗原呈递细胞。</li>
	<li>洗涤完成后，向每孔加入适量培养基以润湿孔底（约 100 μL），避免贴壁细胞干燥。</li>
	<li>向每孔加入 200–300 万个 CD4+ 细胞。如有必要，补充额外培养基使每孔总体积达到 1 mL。</li>
	<li>向每孔加入所需肽段。刺激的典型终浓度为 10 μg/mL。</li>
	<li>将培养板置于 37°C 培养箱中培养 7 天。</li>
	<li>7 天后，向每孔加入 50 μL Hemogen IL-2（或等效物，如重组 IL-2，终浓度为 10 IU/mL）。</li>
	<li>在随后的每一天，使用显微镜监测细胞生长情况。对于尚未达到汇合的孔，移除一半培养基，加入新鲜培养基和 50 μL IL-2 进行换液；对于已汇合的孔，将细胞重悬，取一半细胞转移至新孔，加入新鲜培养基和 50 μL IL-2。将细胞放回培养箱继续培养。</li>
	<li>培养 13–15 天后，扩增的细胞即可用于四聚体检测。</li>
</ol>
4. 通过四聚体染色法可视化T细胞
<ol>
	<li>购买或制备与刺激后的 CD4+ T 细胞相匹配的肽/MHC 四聚体（参见讨论部分关于四聚体试剂来源的信息）。四聚体应为浓度约 0.5 mg/mL 的溶液。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板</li>
	<li>小心吸去每个孔中一半的培养基</li>
	<li>将每个孔中的部分细胞转移至 5 mL 聚苯乙烯 FACS 管中，通常为 75 μL 或约 50,000 个细胞</li>
	<li>加入四聚体，通常每 50 μL 总体积加入 1 μL，并将样本置于 37°C 培养箱中孵育 1–2 小时。建议同时使用错配的四聚体对每个孔的另一份细胞样本进行染色，作为阴性对照。</li>
	<li>通过加入每种抗体 3–10 μL 对细胞进行 CD3、CD4 和 CD25 抗体标记。也可使用其他或替代的抗体标记物。但请勿使用 PE 标记的抗体，因为该通道需保留用于四聚体检测。此时，可使用额外细胞制备单色或同型对照样本。</li>
	<li>将标记抗体的细胞在冰上或 4°C 条件下孵育 15–30 分钟。</li>
	<li>每管加入 0.5 至 2 mL 流式缓冲液洗涤，并在 230×g 离心 10 分钟。</li>
	<li>小心倾去 FACS 管中的上清液。将所有管置于带盖容器中（最好在冰上）保存，用于后续流式细胞分析。</li>
</ol>
5. 流式细胞仪数据采集与分析
<ol>
	<li>使用校准微球校准流式细胞仪。</li>
	<li>验证仪器设置：
	<ol>
		<li>使用未染色的对照细胞或同型对照，调整活淋巴细胞门的位置（FSC 对 SSC）。通过调节增益设置，将各通道的自发荧光群体中心调整至每个坐标轴第一对数区以下，以去除所有通道的自发荧光干扰。</li>
		<li>使用单色对照管，通过调节补偿设置，将各单色信号的事件中心调整至正确的象限内。</li>
		<li>使用一条用无关四聚体染色的样本管对仪器设置进行精细调整。特别是PE通道的设置可能需要调整，因为四聚体染色通常比抗体对照更亮。无关四聚体染色的CD4+细胞比例应小于&lt;0.5%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集每管数据
	<ol>
		<li>采集每个样本管和阴性对照管的事件数据</li>
		<li>采集并保存至少20,000个事件用于分析</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析数据
	<ol>
		<li>将数据文件导入流式细胞分析软件（例如 CellQuest 软件、WinMDI 或 FlowJo）。首先使用无关四聚体染色的样本管开始分析。</li>
		<li>绘制FSC与SSC散点图，并在活淋巴细胞群周围绘制门控（图1，左上图）。</li>
		<li>绘制CD4与CD3散点图（门控限定为活淋巴细胞），并在CD3+和CD4+细胞群周围绘制门控（图1，右上图）。</li>
		<li>绘制CD4与四聚体散点图（门控限定为CD3+淋巴细胞），并设置象限边界，使CD4+四聚体+细胞群比例小于0.5%（图1，左下图）。</li>
		<li>绘制CD25与四聚体散点图（门控限定为CD4+淋巴细胞），并设置象限边界，使CD25+四聚体+细胞群比例小于0.5%（图1，右下图）。</li>
		<li>在不更改门控设置的前提下，分析所有样本管的数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="流式细胞术示意图；淋巴细胞门控及CD3+、CD4+分析；细胞群体区分。" height="342" src="/files/ftp_upload/1167/1167fig1.jpg" width="600" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="图1">
图1. 代表性阴性对照四聚体染色结果。左上图显示前向散射与侧向散射，以及淋巴细胞大小门控（R1）。右上图基于R1门控，显示抗-CD4与抗-CD3染色结果，以及CD3+（R2）和CD4+（R3）门控区域。左下图基于R2门控，显示抗-CD4与四聚体染色结果。右下图基于R3门控，显示抗-CD25与四聚体染色结果。两个四聚体图的象限均设定为0.5%。
6. 典型结果
<ol>
	<li>四聚体阳性细胞应在扩增的 CD4+ 细胞中形成一个明显独立的细胞群（图 2）。</li>
	<li>四聚体阳性细胞通常为 CD25+，且常表现为 CD4 高表达。</li>
	<li>在某些情况下，MHC/肽段组合可能产生背景染色（通常由溶解度较差的肽段引起）。此类背景染色可通过 CD4 与四聚体或 CD25 与四聚体的散点图与真实阳性信号区分开来，因为“假阳性”细胞在这些图中不会形成单一且明显的细胞群（图 3）。</li>
</ol>
<img alt="显示淋巴细胞门控的流式细胞术图示；散点图中的 CD3+、CD4+ 分析。" height="362" src="/files/ftp_upload/1167/1167fig2.jpg" width="600" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="图 2">
图2. 典型的四聚体阳性染色结果。图中布局和设门策略与图1相同。四聚体阳性细胞在抗CD4抗体对四聚体图中表现为明显的CD4高表达群体，在抗CD25抗体对四聚体图中表现为明显的CD25+群体。
<img alt="流式细胞术散点图；淋巴细胞门控，CD3+ 和 CD4+ 细胞分析，荧光数据。" height="336" src="/files/ftp_upload/1167/1167fig3.jpg" width="600" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="图 3">
图3. 典型的“假阳性”四聚体染色结果。该图的面板布局和设门策略与图1相同。抗-CD4与四聚体图显示弥散的“隆起状”染色。抗-CD25与四聚体图也显示“隆起状”染色，且无明显趋向于CD25阳性。

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

了解 CD4+ T 细胞在免疫中的作用具有根本性的重要意义。然而，使用传统方法检测和分离抗原特异性的 CD4+ T 细胞可能较为困难。相比之下，MHC II 类四聚体（tetramer）能够直接可视化具有目标抗原特异性的 CD4+ T 细胞。本视频展示了 CD4+ T 细胞的分离、纯化和体外扩增，以及随后使用四聚体进行检测的流程。II 类四聚体是由可溶性生物素化的 II 类 α/β 二聚体围绕荧光标记的链霉亲和素核心结合而成的荧光蛋白偶联物（图 4）。本视频中使用的四聚体由贝纳罗亚研究所（Benaroya Research Institute）的四聚体核心实验室利用昆虫细胞培养系统制备（1）。这些四聚体以 0.5 mg/mL 的溶液形式保存，可在 4°C 下储存 6 至 18 个月。四聚体切勿冷冻，因为冻融过程可能使藻红蛋白（PE）标记从链霉亲和素核心上脱落。II 类染色试剂可从多个来源获得（表 1），并被命名为四聚体（tetramers）、“ultimers” 和多聚体（multimers）。需要注意的是，此处描述的四聚体检测方法与 I 类四聚体的检测流程不同。I 类四聚体染色通常在 4°C 下效果最佳，而 II 类四聚体染色通常需要...

<table><tbody><tr><td>II级层流生物安全柜</td><td>设备</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>设备</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>1× PBS（无Ca/Mg）</td><td>试剂</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>需用铝箔包裹避光</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP</td><td>设备</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>设备</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>Aerosolve 样品管</td><td>设备</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>配50 mL 插件</td></tr><tr><td>离心机</td><td>设备</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>设备</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>设备</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>溶血缓冲液</td><td>试剂</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>8.3 g/L NH4Cl，1.0 g/L NaHCO3，0.04 g/L 乙二胺四乙酸二钠</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>PBS中0.2%</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>设备</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>设备</td><td>VWR international</td><td>05-527-90</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>运行缓冲液</td><td>试剂</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA</td></tr><tr><td>MACS CD4+ T细胞分离试剂盒II</td><td>试剂</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>EasySep&amp;#174; 磁铁</td><td>设备</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚丙烯管</td><td>设备</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>含25 mM HEPES</td></tr><tr><td>混合人血清</td><td>试剂</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>来自健康供体，经热灭活并过滤</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen Strep）</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>500 mL 0.22 微米瓶顶过滤器</td><td>设备</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>48孔板</td><td>设备</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>设备</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>20 mg/mL 合成多肽</td><td>试剂</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>由任意多肽供应商定制合成</td></tr><tr><td>5 mL FACS 管</td><td>设备</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>聚苯乙烯材质</td></tr><tr><td>多肽负载的II类四聚体（如所述）</td><td>试剂</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>由BRI四聚体核心制备</td></tr><tr><td>抗CD3抗体</td><td>试剂</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>抗CD4抗体</td><td>试剂</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>抗CD25抗体</td><td>试剂</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>Facs Calibur 流式细胞仪</td><td>设备</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>或同类产品</td></tr></tbody></table>

使用mhc ii类四聚体可视化抗原特异性cd4+ t细胞

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

主要组织相容性复合体（MHC）II类四聚体可实现通过流式细胞术直接可视化抗原特异性的CD4+ T细胞。该方法依赖于肽段负载的MHC分子与其相应T细胞受体之间的高度特异性相互作用。尽管单个MHC/肽段分子的亲和力较低，但通过链霉亲和素交联MHC/肽段复合物可增强相互作用的亲合力，从而使其可用作染色试剂。由于CD4+ T细胞的频率相对较低（单个特异性约1/300,000），该检测方法采用体外扩增步骤以提高其检测阈值。单个核细胞通过Ficoll密度梯度离心法从外周血中纯化获得，随后利用生物素标记的抗体混合物及抗生物素包被的磁珠通过阴性选择法分离CD4+细胞。将CD4-细胞组分中的贴壁细胞作为抗原呈递细胞，通过在培养基中加入抗原肽和IL-2对CD4+ T细胞进行扩增。扩增后的细胞与相应的II类四聚体在37°C孵育1小时进行染色，随后使用表面抗体（如抗-CD4、抗-CD3和抗-CD25）进行二次染色。标记完成后，细胞可直接进行流式细胞术分析。四聚体阳性细胞通常在扩增后的CD4+细胞中形成一个明显独立的细胞群，且通常为CD25+，常表现为CD4高表达。由于背景四聚体染色水平可能有所差异，阳性染色结果应始终与同一细胞使用无关四聚体的染色结果进行比较。该基本检测方法存在多种变体。四聚体阳性细胞可被分选用于进一步的表型分析，或用于ELISPOT、增殖实验等其他下游功能检测。已有多个研究团队成功实现了四聚体与抗细胞因子抗体或抗-FoxP3抗体的共染色。

本实验展示了从全外周血中纯化并体外扩增抗原特异性CD4+ T细胞，以及利用MHC II类四聚体对其进行可视化检测的方法。四聚体技术能够直接可视化具有单一抗原特性和明确MHC II类限制性的T细胞。

使用MHC II类四聚体可视化抗原特异性CD4+ T细胞

主要组织相容性复合体（MHC）II类四聚体可实现通过流式细胞术直接观察抗原特异性CD4+ T细胞。该方法……

那么，TeeR 检测真正独特之处在于它能够直接可视化抗原特异性的 T 细胞。这个 te，即 TeeR，是我们检测方法中最独特的部分，再结合我们所进行的扩增步骤。我们知道，首先分离T细胞，然后在一种能够富集我们感兴趣T细胞的环境中进行培养。接着，我们能够对这些特定细胞进行特异性标记，并通过流式细胞仪进行可视化检测。而在此前的检测方法中，例如已经使用数十年的CFSE增殖实验，所获得的仅仅是整个T细胞群体总体的宏观测量结果。但人体内有数百万个T细胞，它们能够识别各种各样的模式。如果你足够幸运，可能在每20万到30万个细胞中才会找到一个你正在寻找的目标细胞。因此，这种检测方法需要进行富集步骤。然后通过检测数量，由于是直接染色，你实际上可以在背景之外观察到占细胞总数不到1%的细胞群体。因此，你可以发现非常微小的差异，并能够相对精确地计数血液样本中、即该个体中能够识别你所关注模式的T细胞数量。但这还远未结束，因为四聚体还允许你不仅标记这些T细胞，而且能够将它们分离出来用于进一步分析。你们所使用的四聚体实际上是在BRI这里制备的，是这样吗？是的。我们是全国极少数能够成功制备II类四聚体的实验室之一。我们的目标是以成本价将这些试剂提供给任何有意引进该技术的实验室。您认为在其他实验室中重复该检测时，最具挑战性或最困难的方面是什么？嗯，我认为主要有两点，首先是T细胞的培养。这确实有点像一门艺术。您每天几乎都需要做出决定，判断细胞是否需要额外的营养物质或更大的生长空间。而我认为，对于缺乏经验的操作者来说，第二个可能最难的部分是数据分析：需要判断信号中的哪一部分确实是阳性反应，而哪一部分仅仅是物理作用或非特异性吸附所固有的背景信号。而且，所有物质在某种程度上都具有一定的黏附性，这一点同样需要大量经验才能掌握，尤其是在整体反应较弱的情况下。目前，您通过该检测所获得的信息，对患者可能带来哪些益处？在自身免疫性疾病患者中，最早出现的标志性特征之一就是一组针对该疾病的特异性抗体谱。根据免疫学的基本原理，我们知道，只要有抗体反应，必然首先存在T细胞反应。因此，如果我们能够观察处于风险中的个体，检测到在抗体形成之前出现的T细胞活性升高，这将有助于我们定义一种新的风险层级，识别出即将产生自身抗体的个体，从而有望为干预性治疗打开一个时间窗口。该实验方案将纯化并扩增抗原特异性的CD4阳性T细胞，并利用四聚体试剂和II级层流生物安全柜等设备对这些细胞进行可视化检测。这将是实验操作的主要工作区。50 毫升锥形管，用于 PBMC 分离的主要试管，一份 XPBS。XPBS 应不含钙和镁，用铝箔包裹以避光。移液器辅助装置，CoStar 10 毫升移液管，配有 50 毫升插入件的气溶胶防护容器，用于防止血液污染离心机。GS six R 离心机，移液管，巴斯德移液管，溶血缓冲液，每升含 8.3 克氯化铵、1.0 克碳酸氢钠、0.04 克二水合 EDTA 三钠，PBS 中含 0.2% 台盼蓝溶液，血细胞计数仪，15 毫升锥形管，运行缓冲液含 PBS 并添加 2 毫摩尔 EDTA 和 5 克每升的 BSA。BSA max CD 四分离试剂盒二购自 Milin 生物技术公司，EP 磁力架购自干细胞技术公司。其他磁性细胞富集平台也可使用，且具有同等效果。5 毫升聚丙烯管，RPMI 1640 培养基添加 25 毫摩尔 HEPES 用于制备 T 细胞培养基，混合人血清用于补充 T 细胞培养基，Pen-Strep 用于补充 T 细胞培养基，500 毫升 0.22 微米瓶顶滤器，无菌 48 孔板用于体外扩增培养，37 摄氏度 CO2 培养箱，20 毫克/毫升含目标表位的合成肽溶液。使用5 mL聚苯乙烯流式管，装载肽段的II类四聚体用于可视化抗原特异性T细胞，抗CD3、抗CD4和抗CD25抗体用于包被抗原特异性T细胞。在开始实验前，使用Fax caliber流式细胞仪或同等设备。将所有材料和仪器组装至实验工作区。以下演示将涵盖以下步骤：PBMC 的分离、CD4 阳性 T 细胞的分离、体外扩增培养，以及通过显微镜观察或染色对 T 细胞进行可视化。第一步：PBMC 分离。采集血样。应使用注射器或采血管收集血液，并按1:50的比例加入肝素抗凝，以防止血液凝固，预计每毫升血液可获得约100万个外周血单个核细胞（PBMC），其中约40%为CD4阳性T细胞。将血液分装至50毫升锥形管中，每管25毫升。在气液界面（ALI）凝固前轻轻混匀血液，以均匀分布血浆。加入 PBS，使总体积达到 40 毫升，并通过将 11 毫升菲亚尔（fial）插入血清管中并小心地从移液管上取下移液器辅助装置来进行下层铺垫。菲亚尔将缓慢流入管底。待液面平衡后，缓慢将移液管从血清管中取出，弃去管帽，盖紧血清管，并将其转移至气溶胶罐中。将罐体牢固关闭，并在无刹车条件下以900 × g离心20分钟。此步骤的关键在于离心结束时不得使用刹车，因为刹车产生的力量会扰动离心后形成的细胞层。单个核细胞（PBMC）应在上方黄色血浆层与下方透明液体层之间形成清晰的白色层。使用移液管轻轻吸除白细胞层，并转移至新管中。此过程中可能会吸入部分血浆和菲可，但应避免吸入任何红细胞层。通常在此步骤可将两管血液合并至一个细胞管中。为增大沉淀物体积，加入PBS使总体积达到15毫升，然后以500 × g离心15分钟（低刹车，防气溶胶），用移液管小心吸去上清液，注意不要扰动沉淀。每管加入5至6毫升溶血缓冲液进行处理，轻轻混匀以去除团块。孵育时间不得超过5分钟。加入 PBS 至终体积为 50 毫升，于 230 × g 离心 10 分钟。低刹车条件下，气溶胶罐在这些较慢的离心中已不再需要。洗涤两次：使用移液管吸除液体，用 PBS 重悬菌体，于 230 × g 离心 10 分钟。在最后一次洗涤步骤前，取一部分重悬的细胞，用台盼蓝稀释，使用血细胞计数板进行计数。细胞计数将决定T细胞分离过程中所用试剂的体积。第二步，CD4阳性T细胞分离：吸除液体，加入运行缓冲液，使总体积达到每1000万细胞40微升。通常需要加入30微升缓冲液加上残留沉淀的体积。将此体积转移至一个15毫升锥形管中。加入CD4分离试剂盒中的抗体混合液，每1000万个细胞加入10微升，置于冰上孵育10分钟。从冰上取出管子，打开管盖，每1000万个细胞加入30微升运行缓冲液。加入CD4分离试剂盒中的磁珠，每1000万个细胞使用20 µL，混匀后置于冰上15分钟。用10倍体积的运行缓冲液洗涤，并在230 × g下离心10分钟。离心过程中，在实验区域准备好磁铁和5毫升聚丙烯管。用移液器吸去细胞沉淀中的液体，加入2毫升洗脱缓冲液，并用移液器去除团块。使用同一支移液管将细胞转移至5 mL离心管中，并在磁力架上孵育15分钟。将磁力架翻转，小心地将CD4阳性T细胞组分倾入已标记的15 mL离心管中，注意保留最后一滴液体。向5 mL离心管中加入另外2 mL冲洗缓冲液，然后从磁力架上取下。轻轻冲洗CD4阴性细胞，使其从管壁脱离，并转移至已标记的15毫升离心管中。每管加入2毫升T细胞培养基。取少量细胞悬液用于计数，然后以230 ×g离心10分钟。用台盼蓝稀释细胞等分试样，并使用血细胞计数板进行计数。这些细胞计数结果将决定扩增培养所用的孔数。第三步。根据细胞计数，分别对CD4阳性与CD4阴性细胞沉淀进行体外扩增培养并吸取培养液。向CD4阳性细胞中加入培养基，调整细胞浓度至每毫升300万个细胞。向CD4阴性细胞中加入培养基，调整细胞浓度至每毫升1000万个细胞。扩增培养每孔需要 300 万 CD4 阴性细胞，以及每孔 200 至 300 万 CD4 阳性细胞。通常情况下，CD4 阳性细胞是限制性细胞群体。将 CD4 阴性细胞分装至 48 孔板的相应孔中。每孔加入 300 微升，将培养板置于 37 摄氏度培养箱中孵育 1 小时。取出培养板，移除培养箱中的液体，通过每孔加入 500 微升新鲜培养基，并使用移液管轻柔吹打 12 至 20 次，然后吸去全部液体以洗涤孔板。此洗涤步骤将留下一层贴壁的抗原呈递细胞。洗涤完成后，加入适量培养基以浸润每个孔的底部，大约 100 µL。否则，贴壁细胞将会干燥。如有必要，向每个孔中加入 200 万至 300 万个 CD4 阳性细胞。加入额外的培养基，使每孔的总体积达到一毫升。向每孔加入所需的肽。刺激的典型浓度为每毫升10微克。将最终的培养板置于37摄氏度培养箱中培养七天。七天后，从次日开始，每天向每孔加入50微升hemo IL-2。使用显微镜监测细胞生长情况，对于尚未达到汇合的培养孔，移除一半培养基，加入新鲜培养基和 50 微升 IL；对于已汇合的培养孔，通过重悬细胞，将一半细胞转移至一个新的空孔中，加入新鲜培养基和 50 微升 IL，然后将细胞放回培养箱中继续培养。扩增的细胞在培养 13 至 15 天后即可用于 TEER 染色。第四步，通过四聚体染色法可视化T细胞，购买或制备与肽段匹配的四聚体，用于刺激CD4阳性T细胞。从培养箱中取出培养板。小心地从每个孔中吸出一半的培养基。通常将每个孔中的75微升或约50,000个细胞转移至一个5毫升的聚苯乙烯Fax管中，加入teer，通常每50微升总体积加入1微升，并在37°C培养箱中孵育1小时。建议同时将每个孔的另一份等分试样用不匹配的teer进行染色，作为阴性对照，并用抗CD3、抗CD4和抗CD25抗体标记细胞。可使用其他或替代的抗体标记物。但请勿使用 PE 标记的抗体，因为目前该通道必须保留用于 teems。此外，使用额外的细胞标记任何单色或同型对照。将抗体标记的细胞在4°C孵育15至30分钟。每管加入0.5至1毫升运行缓冲液洗涤，然后在230 × g离心10分钟。小心弃去上清液，使用参考微球、单色对照管、同型对照等校准流式细胞仪。使用流式细胞仪分析每个试管。四聚体阳性细胞应在扩增的CD4阳性T细胞中形成一个明显独立的细胞群。四聚体阳性细胞通常为CD25阳性，且常为CD4高表达。

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生物学

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