Name: 牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析:第1部分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学习使用牛痘病毒感染HeLa细胞并进行时空基因表达分析的方法。本实验方案涵盖病毒感染、RNA提取及后续微阵列分析的关键步骤，为研究病毒与宿主相互作用提供可靠技术基础。

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怀特黑德研究所研究员基金

第1部分：建立感染模型
<ol>
<li>在培养瓶中培养 HeLa 细胞，直至细胞融合度达到约 80%。</li>
<li>为实验准备足量的病毒生长培养基：含 2% 胎牛血清（FBS）且不添加抗生素的常规 DMEM 培养基。</li>
<li>感染可使用已知滴度的粗制痘苗病毒原液，或使用已知滴度的蔗糖纯化病毒；若关注宿主基因表达，建议使用后者。</li>
<li>若使用蔗糖纯化病毒，可直接进入第 2 部分。</li>
<li>若使用粗制痘苗病毒原液，在感染前需将病毒分装样品置于盛有冰水混合物（以冰为主，加少量水）的杯状超声仪中进行超声处理。
<ul style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>以约 30 W 功率超声处理 20 秒。</li>
<li>涡旋混匀后重复超声处理共 3 次，过程中根据需要添加冰块，确保超声杯始终被冰紧密填充并保持低温。</li>
<li>每次超声处理之间均需进行涡旋混匀。</li>
<li>完成后进入第 2 部分。</li>
</ul>
</li>
<li>或者，若无杯状超声仪，可将等体积的粗制病毒原液与 0.25 mg/mL 胰蛋白酶混合。
<ul style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>剧烈涡旋混匀。</li>
<li>将病毒原液与胰蛋白酶的混合物置于 37°C 水浴中孵育 30 分钟。</li>
<li>每 5–10 分钟涡旋一次。</li>
<li>完成后进入第 2 部分。</li>
</ul>
</li>
</ol>
第二部分：感染细胞
<ol>
<li>计算感染单层细胞所需的病毒颗粒数量，以达到预期的感染复数（MOI）。通常，在进行感染时间进程实验时，使用较高的感染复数（MOI 介于 5 至 10 之间）。</li>
<li>将所需量的蔗糖纯化病毒或胰蛋白酶处理的粗制病毒加入 37°C 的病毒生长培养基中，并充分混匀。所用培养基的量应足以覆盖培养瓶底部即可。例如，T-175 培养瓶使用 10 mL 培养基。</li>
<li>移除细胞中的培养基，并用室温 PBS 洗涤一次。</li>
<li>将病毒/病毒生长培养基加入每个培养瓶中。
<ul style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>轻轻摇晃，倾斜培养瓶，然后在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 1 小时。</li>
<li>每 15 分钟倾斜并摇晃一次培养瓶，以使病毒均匀分布并保持细胞湿润。</li>
<li>对于 0 小时/模拟感染（Mock）时间点，仅加入病毒生长培养基，不添加病毒。</li>
</ul>
</li>
<li>1 小时孵育后，移除含病毒的培养基，并用室温 PBS 洗涤三次。</li>
<li>向每个培养瓶中加入最大量的病毒生长培养基。例如，T-175 培养瓶加入 30 mL 培养基。从此刻开始计为 0 小时时间点。</li>
</ol>
第3部分：收集细胞
<ol>
<li>在显微镜下观察细胞，并记录任何细胞病变效应（CPE）。</li>
<li>移除培养基，并用30 mL室温的PBS冲洗细胞。</li>
<li>向细胞中加入15 mL胰蛋白酶，于37°C孵育2-5分钟。</li>
<li>在显微镜下检查细胞是否脱落，并轻轻敲击培养瓶以使细胞脱离。</li>
<li>用无菌血清移液管将细胞转移至50 mL锥形管中。</li>
<li>用等体积的细胞生长培养基洗涤培养瓶，并将该培养基加入锥形管中的胰蛋白酶处理细胞中。</li>
<li>在室温下以300 × g 离心5分钟。</li>
<li>移除细胞沉淀中的胰蛋白酶/培养基。</li>
<li>将细胞沉淀重悬于TRIzol试剂中，或重悬于所选RNA提取试剂盒的裂解缓冲液中。</li>
<li>若使用TRIzol，将样品分装为每管1 mL，置于已标记的1.5 mL离心管中，并于-80°C冷冻保存。</li>
<li>对所有时间点重复上述操作，每个时间点收获一个培养瓶。</li>
</ol>
第4部分：使用TRIzol提取样品中的RNA
<ol>
<li>此时，您的样品应已重悬于TRIzol试剂中，可进行后续处理。</li>
<li>每1 mL TRIzol加入200 µL BCP相分离试剂。如果起始使用的TRIzol体积较大，可能需要将样品转移至更大的离心管中。</li>
<li>充分涡旋或剧烈震荡，并在室温下孵育2–3分钟。</li>
<li>在12,000 × g条件下离心15分钟。</li>
<li>将水相转移至新的离心管中。水相为上层透明液体。每1 mL起始TRIzol应可回收约600 µL水相。</li>
<li>进行第二次酚/氯仿抽提，此次每1 mL TRIzol使用500 µL氯仿，代替BCP试剂。</li>
<li>充分涡旋或剧烈震荡，并在室温下孵育2–3分钟。</li>
<li>在12,000 × g条件下离心15分钟。</li>
<li>将水相转移至新的离心管中。水相为上层透明液体。</li>
<li>向每个样品中加入20 µg线性丙烯酰胺。线性丙烯酰胺作为载体，有助于RNA沉淀。</li>
<li>每1 mL起始TRIzol加入500 µL异丙醇，充分混匀。</li>
<li>在室温下孵育10分钟。</li>
<li>在微量离心机中以最大转速离心10–15分钟。</li>
<li>RNA沉淀将可见于管底。请非常小心地用真空抽吸装置或移液器手动去除上清液，切勿扰动沉淀。</li>
<li>用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀。
<ul style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>向沉淀中加入1 mL 70%乙醇。</li>
<li>在14,000 × g下高速离心5–7分钟。</li>
<li>非常小心地用真空抽吸装置或移液器手动去除乙醇。检查确认沉淀仍位于管底。</li>
<li>弃去上清液。</li>
</ul>
</li>
<li>重复洗涤步骤。弃去上清液后，在管壁上标记沉淀位置。</li>
<li>将沉淀在空气中干燥，时间不超过5分钟。切勿过度干燥，否则RNA将难以重悬！</li>
<li>如需进行可选的DNase处理以去除样品中残留的DNA，请将沉淀重悬于17 µL无核酸酶水中；否则，将沉淀重悬于20 µL无核酸酶水中，并继续进行第22步。</li>
<li>（可选DNase处理）使用Qiagen无RNase的DNase试剂盒，向重悬的RNA中加入2 µL Buffer RDD和1 µL重悬的无RNase DNase I，轻轻混匀。</li>
<li>（可选DNase处理）在37°C孵育30分钟。</li>
<li>（可选DNase处理）加入2 µL 2.5 mM EDTA，在65°C孵育5分钟以灭活DNase。切勿超过该灭活时间或温度，否则可能导致RNA降解。</li>
<li>使用分光光度计检测RNA浓度。</li>
<li>将RNA样品储存于-80°C。</li>
<li>（可选质量控制）使用Agilent BioAnalyzer检测RNA质量，或通过变性凝胶电泳分析样品并检测OD值（260 nm及260/280比值）。</li>
</ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

关键步骤
第1和第2部分
建立同步性痘苗病毒感染有几个关键步骤，第一步是仔细对病毒进行超声处理（或胰蛋白酶处理），以使病毒颗粒解聚。痘苗病毒极易发生聚集，因此破坏病毒颗粒对于确保细胞感染的均匀性至关重要。为了实现同步感染，应使用较高的感染复数（MOI 大于 2），以确保每个细胞都被感染。若存在感染细胞与未感染细胞的混合，将导致多轮感染、时间点的异质性混合，以及病毒和宿主转录反应的异步发生。感染过程中应使用最少量的培养基，以促进病毒最大限度地吸附到细胞上。此外，定期摇动培养瓶或培养皿（每 10 分钟一次）有助于病毒在培养容器内的均匀分布，并防止细胞干燥。
第4部分
使用1-溴-3-氯丙烷（BCP）替代苯酚以减少基因组DNA的污染。后续可选择性地进行DNA酶处理（Qiagen RNA酶-free DNA酶），以彻底清除残留的基因组DNA。第二次氯仿抽提用于去除提取物中残留的微量有机溶剂，因为即使痕量的有机溶剂也可能抑制后续的扩增...

<table><tbody><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>类似试剂（如 Roche 的 TriPure）也可使用。</td></tr><tr><td>BCP 相分离试剂</td><td>试剂</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 的 DNase 试剂盒</td><td>试剂</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase 处理为可选步骤。</td></tr></tbody></table>

痘苗病毒侵染及病毒基因表达的时间进程分析：第一部分

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

该科Poxviridae由含有大型双链DNA的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科的成员包括orthopox属包括引起人类天花的病原体——天花病毒、猴痘病毒以及痘苗病毒（VAC），后者是该病毒科的典型代表。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但每一类在病毒生命周期中发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主和病毒基因表达的调控机制，我们采用了全基因组方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了用痘苗病毒感染HeLa细胞的时间过程实验，并在感染后的多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。

HeLa 细胞的痘苗病毒感染实验方案及宿主与病毒基因表达分析。第 1 部分（共 3 部分）。

痘病毒科（Poxviridae）由含有大型双链DNA的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科……

使用痘苗病毒对 HeLa 细胞进行时间进程感染，首先建立病毒感染体系，感染细胞，然后在感染后的多个时间点收集感染细胞的 RNA。这些 RNA 随后可进行扩增，并用于与微阵列杂交，以分析基因表达。大家好，我是来自怀特黑德生物医学研究所 Kate Irvins 实验室的 Judy Ann。今天，我们将向您展示一种在哺乳动物细胞中进行痘苗病毒时间进程感染的实验方法，以及在感染后不同时间点从感染细胞中提取RNA的后续步骤。该技术是更大实验方案的初步步骤，旨在提取并扩增RNA，以评估病毒感染过程中病毒基因的表达情况，完整的流程将在另外两部JoVE视频中呈现。现在让我们开始：为进行感染实验，需在培养瓶中培养HeLa细胞，并等待细胞生长至约80%汇合度。接下来，务必为实验准备足量的病毒生长培养基。使用含2%FBS且不添加抗生素的常规DMEM，可通过已知滴度的自备痘苗病毒库存或已知滴度的蔗糖纯化病毒进行感染。如果您关注宿主基因表达，且正在使用蔗糖纯化病毒，请跳至下一节。如果使用的是粗制的痘苗病毒，请在感染前对病毒进行超声处理并分装。使用装有大量冰和少量水的烧杯作为浴液，以约 30 W 的功率超声处理 20 秒。涡旋混匀试管，重复超声处理三次，每次需添加更多冰以确保烧杯内充满冰并保持低温；每次超声处理之间务必进行涡旋混匀。若无烧杯式超声仪，则将粗制病毒原液与等体积的 25 毫克/毫升溶液混合。剧烈涡旋胰蛋白酶，将病毒原液分装后置于37摄氏度水浴中孵育30分钟，期间每5至10分钟涡旋一次以充分混匀，用于感染细胞。首先，计算在所需感染复数下感染单层细胞所需的病毒颗粒数量。或感染复数（MOI）。通常在感染时间进程实验中使用5至10之间的高MOI。接下来，将所需量的蔗糖纯化病毒或裂解粗制病毒加入37摄氏度的病毒生长培养基中，并充分混匀。应使用足量的培养基以刚好覆盖培养瓶底部为宜。对于T175培养瓶，10毫升培养基即可。移除细胞中的培养基，并用室温的PBS冲洗。向每个培养瓶中加入病毒或病毒生长培养基，以建立零小时的模拟时间点。仅加入病毒生长培养基而不添加病毒，轻轻旋转并倾斜培养瓶，在37°C、5% CO2的培养箱中孵育1小时。务必每15分钟倾斜和旋转培养瓶一次，以使病毒均匀分布并保持细胞湿润。孵育后，移除含有病毒的培养基，用室温的 PBS 洗涤三次。向每个培养瓶中加入最大量的病毒生长培养基。例如，T175 培养瓶中加入 30 毫升培养基。可在感染后所需时间点从此刻开始计为零小时时间点。在显微镜下观察细胞，并记录任何细胞病变效应（CPE）。移除培养基，并用 30 毫升室温 PBS 洗涤细胞。接着，向细胞中加入 15 毫升胰蛋白酶，于 37 摄氏度孵育 2 至 5 分钟。在 37 摄氏度下，于显微镜下观察细胞脱落情况，并轻轻敲击培养瓶以使细胞脱落。用无菌的血清移液管将细胞转移至一个50毫升的锥形管中。用与之等体积的细胞培养基洗涤培养瓶，并将培养基加入锥形管中的胰酶消化细胞中。在室温下以500 ×g离心5分钟。离心后，从细胞沉淀中去除裂解液，重悬细胞沉淀，并加入适量三相裂解试剂或所选RNA提取试剂盒的裂解缓冲液。若使用三相裂解试剂，将样品分装至1 mL离心管和1.5 mL带标记的微量离心管中，于-80 °C冷冻保存。对所有时间点重复此步骤。每个时间点收获一个培养瓶。此时，您的样品应已重悬，并含有三醇试剂，可进行后续处理。加入 200 µL 的 BCP 相分离试剂。每管中每1毫升三醇，使用BCP或1-溴-3-氯丙烷代替苯酚。为减少基因组DNA污染，可能需要将样品转移至更大的离心管中。如果起始三醇量较大，请涡旋或剧烈振荡，并在室温下孵育2至3分钟。孵育后，在12,000 ×g下离心15分钟。水相应呈现为顶部清晰的一层。将水相转移至新的离心管中。每毫升起始的三唑溶液，应可回收约600微升。进行第二次苯酚-氯仿抽提。此次每1毫升三唑使用500微升氯仿，代替BCP。第二次氯仿抽提的目的是去除提取物中残留的有机溶剂痕迹，因为即使微量的有机溶剂也可能抑制后续的扩增步骤。涡旋或剧烈振荡，然后在室温下孵育两到三分钟。离心样品，12,000 ×g 离心15分钟。将上清相转移至新的无菌离心管中。请注意，水相是顶部的透明层。接下来，向每个样品中加入 20 µg 线性丙烯酰胺。线性丙烯酰胺起到载体作用，有助于 RNA 沉淀。每毫升起始的三醇样品中加入 500 微升异丙醇，并充分混匀。将样品在室温下充分孵育 10 分钟，孵育后在微型离心机中以最大速度离心 10 至 15 分钟。离心后，RNA 沉淀将可见于离心管底部。非常小心地使用真空抽吸装置或移液器手动从离心管中去除上清液，切勿扰动沉淀物。用一毫升70%乙醇洗涤沉淀物，并以最高速度离心5至7分钟。非常小心地操作。使用真空抽吸装置或移液器手动从离心管中去除乙醇。弃去上清液。检查管底是否可见沉淀。弃去上清液后，重复此洗涤步骤。在管壁上标记沉淀的位置。将沉淀在空气中干燥，时间不超过五分钟。切勿过度干燥，否则RNA将难以重新溶解。接下来，如果计划进行DNA的处理，则将沉淀悬浮于17 µL无核酸酶的水中。若不进行DNase处理，则将样品悬浮于20 µL中。对于DNase处理，使用KaiGen无RNA酶的DNA提取试剂盒，加入2 µL缓冲液RDD和1 µL重悬的无RNA酶制剂。将DNA加入重悬的RNA中，轻轻混匀，在37摄氏度孵育30分钟。随后，加入2微升2.5毫摩尔的EDTA，在65摄氏度孵育5分钟。为使DNA失活，请勿超过规定的失活时间或温度，因为更长的时间或更高的温度可能导致RNA降解。现在您已完成DNA的处理。使用分光光度计检测RNA浓度。在260纳米标准峰之外，270纳米处的尖峰可提示存在酚或BCP残留。提取总RNA后测定其吸光度时，若出现此类污染，应在进行扩增前采用滤膜或柱式RNA提取方法重新纯化RNA。RNA样本可保存在负80摄氏度。如需评估RNA质量，可使用安捷伦生物分析仪，或在变性凝胶上电泳样本，并通过生物分析仪检测OD读数。良好的RNA质量由RNA完整性编号（RIN）表示。RIN基于1到10的评分系统，其中1表示降解最严重的RNA，10表示最完整的RNA。我们刚刚向您展示了如何使用痘苗病毒进行时间进程感染，以及如何在感染后的不同时间点从感染细胞中提取RNA。进行此操作时，需要注意在建立同步的痘苗病毒感染过程中有几个关键步骤。首先是仔细进行病毒的超声处理或胰蛋白酶消化。由于痘苗病毒极易聚集，因此必须将病毒颗粒充分分散，以避免细胞感染不均。其次，为了实现非同步感染，应使用大于2的高感染复数（MOI），以确保每个细胞都被感染。感染细胞与未感染细胞的混合物将导致多轮感染、不同时间点的异质混合，以及病毒和宿主转录反应的非同步性。第三，感染过程应在最小体积的培养基中进行，以促进病毒最大程度地吸附到细胞上。此外，每隔 10 分钟定期振荡培养瓶或培养皿，可使病毒在培养瓶内均匀分布，并确保细胞不会干燥。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。请务必观看本系列中的其他视频，我们将展示RNA样本的线性扩增以及荧光标记RNA的制备和纯化过程。

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