牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析:第1部分
April 8th, 2009
协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。
使用牛痘病毒对 hela 细胞进行时程感染首先建立病毒感染，感染细胞，然后在感染后的几个时间点从感染细胞中收集 RNA。该 RNA 随后可以扩增以杂交到微阵列中，以分析基因表达。大家好，我是来自怀特黑德生物医学研究所 Kate Irvins 实验室的 Judy Ann。
今天，我们将向您展示哺乳动物细胞中牛痘病毒的时间过程感染以及随后在感染后不同时间点从感染细胞中提取 RNA 的程序。该技术是旨在提取和扩增 RNA 以评估感染期间病毒基因表达的更大方案的开始步骤，该方案将在另外两个 JoVE 视频中完成。那么，让我们开始吧：为了应对感染，培养 hela 细胞和培养瓶，并等待细胞大约 80% 汇合。
接下来，请务必为实验准备足够的病毒生长培养基。使用含 2% FBS 且不添加抗生素的常规 DMEM，可以使用募集的具有已知滴度的牛痘病毒原液或具有已知滴度的蔗糖纯化病毒进行感染。如果您担心宿主基因表达，如果您使用的是蔗糖纯化的病毒，请跳至下一个会话。
如果您使用的是粗痘苗病毒，请在感染前对病毒进行原液超声处理和等分试样，并在杯子中用主要包含冰和少量水的浴对 30 W 左右进行超声处理 20 秒。涡旋试管并重复超声处理 3 次，如果需要，加入更多冰块，以保持杯子装满冰块并冷却，确保在每个超声处理步骤之间涡旋。如果您没有杯子，请以每毫升 25 毫克的浓度混合等体积的粗病毒原液。
胰蛋白酶涡旋剧烈孵育病毒原液，并在 37 摄氏度的水浴中混合 30 分钟。每隔 5 到 10 分钟涡旋一次以感染细胞。首先，计算以所需的感染复数感染单层所需的病毒颗粒量。
或 MOI。通常，感染时间病程使用 5 到 10 之间的高 MOI。接下来，将所需量的蔗糖纯化病毒或胰蛋白酶粗病毒添加到 37 摄氏度的病毒生长培养基中并充分混合。
您应该使用足够的培养基刚好覆盖培养瓶的底部。10 mL 培养基对于培养瓶 T 1 75 就足够了。从细胞中取出培养基并用室温冲洗。PBS 的。
将病毒或病毒生长培养基添加到每个培养瓶中，以获得零小时模拟时间点。仅添加病毒生长培养基，不添加病毒，轻轻旋转，然后将在 5% CO2 培养箱中孵育 37 摄氏度的板倾斜 1 小时。确保每 15 分钟倾斜和旋转一次板，以均匀传播病毒并保持细胞湿润。
孵化后。去除含有病毒的培养基，并在室温下冲洗 3 次。PBS 的。向每个培养瓶中加入最大量的病毒生长培养基。
例如，T 1 75 培养瓶的 30 mL 培养基。您可以开始将此计为所需时间点的零小时时间点。感染后。在显微镜下检查细胞并注意任何细胞病变效应或 CPE。
去除培养基并用 30 毫升室温 PBS 冲洗细胞。接下来，向细胞中加入 15 毫升胰蛋白酶，孵育 2 到 5 分钟。在 37 摄氏度下，在显微镜下检查细胞是否脱落，然后轻轻敲击培养瓶以去除细胞。
用无菌血清移液管将细胞转移到 50 mL 锥形管中。用等体积的细胞生长培养基洗涤培养瓶，并将培养基添加到锥形管中的胰蛋白酶细胞中。在室温下以 500 G 离心细胞 5 分钟。
离心后，从重悬的细胞沉淀物、细胞沉淀物、三醇试剂或所需 RNA 分离试剂盒中的裂解缓冲液中去除试用蛋白酶培养基。如果您使用的是三醇，请将样品分成 1 毫升季铵盐和 1.5 毫升标记的 eend 矮管，并在负 80 摄氏度下冷冻。对所有时间点重复此作。
每个时间点收获一个烧瓶。此时，应重新悬浮样品并使用 triol 试剂，并准备好进行处理。加入 200 μL BCP 相分离试剂。
每管中每 1 毫升三醇，使用 BCP 或 1 溴三氯丙烷代替苯酚。为了减少基因组 DNA 污染，您可能需要将样品转移到更大的试管中。如果您开始时出现大量三醇涡旋或剧烈摇晃，并在孵育后在室温下孵育 2 至 3 分钟，离心后将样品以 12， 000 GS 离心 15 分钟。
acqui 阶段应显示为顶部的透明层。将默许期转移到新试管中。您开始时每毫升三唑应该回收大约 600 微升。
进行第二次苯酚氯仿提取。这次每 1 毫升三唑使用 500 微升氯仿而不是 BCP。第二种氯仿萃取用于从萃取中去除任何痕量有机溶剂，因为即使是痕量也会抑制后续的扩增步骤。
涡旋或剧烈摇晃，然后在室温下孵育 2 到 3 分钟。离心后，将样品以 12， 000 GS 离心 15 分钟。将默许期转移到新试管中。
请记住，水相是顶部的透明层。接下来，向每个样品中加入 20 μg 线性丙烯酰胺。线性丙烯酰胺充当载体，有助于沉淀 RNA。
在每个样品中，每 1 毫升三醇加入 500 微升异丙醇，然后混合。孵育后，将样品在室温下孵育 10 分钟，离心机和微量离心机以最大速度孵育 10 至 15 分钟。离心后，RNA 沉淀将在试管底部可见。
非常小心地，用真空抽吸器或移液器手动从试管中取出上清液。不要打扰颗粒。用 1 毫升 70% 乙醇洗涤沉淀，并以最高速度离心 5 至 7 分钟。
非常小心。用真空吸气器或移液器手动从试管中除去乙醇。丢弃上清液。
检查颗粒是否在试管底部可见。弃去上清液后重复此洗涤步骤。标记颗粒在试管上的位置。
将颗粒风干不超过 5 分钟。不要过度干燥，否则 RNA 将难以重构。接下来，如果计划对 DNA 进行复苏，请将沉淀悬浮在 17 μL 无核酸酶水中。
如果没有 D'S 治疗计划，复苏暂停 20 μL。对于 D'S 处理，请使用 KaiGen 游离 RNA 的 DNA 套装。添加 2 μL 缓冲液、RDD 和 1 μL 游离重组 RNA。
DNA 一到重悬的 RNA，在 37 摄氏度下轻轻孵育 30 分钟。接下来，加入 2 微升 2.5 毫摩尔 EDTA，并在 65 摄氏度下孵育 5 分钟。要灭活 DNA，不要超过灭活时间或温度，因为更长的时间和更高的温度会导致 RNA 降解。
现在您已经完成了 DNA 的处理。通过分光光度计检查 RNA 浓度。痕量苯酚或 BCP 可在 260 纳米的标准峰之外 270 纳米处检测到尖峰。
在提取后测量总 RNA 的吸光度时，如果出现此类污染，请在进行扩增之前使用过滤器或基于柱的 RNA 提取方法回缩 RNA。您可以将 RNA 样品储存在零下 80 摄氏度。如果需要，您可以使用安捷伦生物分析仪或在变性凝胶上运行样品并在生物分析仪上检查 OD 读数来检查 RNA 质量。
良好的 RNA 质量由 RNA 完整性值或 RIN 表示。RIN 基于从 1 到 10 的编号系统，其中 1 表示退化程度最高的配置文件，10 表示最完整的配置文件。我们刚刚向您展示了如何进行牛痘病毒的时间过程感染，以及如何在感染后的不同时间点从感染细胞中提取 RNA。
执行此程序时，请务必记住，设置同步牛痘感染有几个关键步骤。首先小心地对病毒进行超声处理或胰蛋白酶化。解聚病毒颗粒很重要，因为牛痘极易聚集，这将防止细胞均匀感染。
其次，为了实现异步感染，应使用大于 2 的高 MOI 来确保每个细胞都被感染。感染细胞和未感染细胞的混合物将导致多轮感染、时间点的异质混合以及病毒和宿主转录反应的异步。第三，感染应在最少量的培养基中进行，以允许病毒最大限度地吸收到细胞上。
此外，每 10 分钟定期摇动培养瓶或培养皿，可以使病毒在培养瓶中分布，并确保细胞不会变干。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
请务必观看本系列中的其他视频，其中介绍了 RNA 样品线性扩增的程序以及荧光标记 RNA 的制备和纯化。
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概述
本协议概述了用痘苗病毒感染HeLa细胞并分析由此产生的宿主和病毒基因表达的过程。该程序包括在感染后的不同时间点从受感染的细胞中收集RNA。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 细胞生物学
- 基因表达分析
背景
- 痘苗病毒作为研究病毒感染的模型。
- HeLa细胞常用于病毒学研究。
- RNA提取对于分析基因表达至关重要。
- 本协议是旨在了解病毒基因表达动态的系列研究的一部分。
研究目的
- 建立用痘苗病毒感染HeLa细胞的方法。
- 分析响应病毒感染的时间基因表达变化。
- 为进一步研究病毒-宿主相互作用提供基础技术。
使用的方法
- 在HeLa细胞中设置病毒感染。
- 在感染后的多个时间点收集RNA。
- 扩增RNA以进行微阵列杂交。
- 分析宿主和病毒基因的基因表达谱。
主要结果
- 成功感染HeLa细胞的痘苗病毒。
- RNA提取产生了足够的材料用于分析。
- 在不同时间点观察到基因表达变化。
- 数据支持对病毒基因表达进行进一步研究。
结论
- 本协议提供了一种研究痘苗病毒感染的可靠方法。
- RNA提取和分析对于理解病毒动态至关重要。
- 研究结果可以为未来的病毒致病机制研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables time-resolved analysis of host and viral gene expression during vaccinia virus infection, providing a mechanistic framework for antiviral target validation. By capturing temporal transcriptional dynamics, it supports de-risking of early-stage antiviral candidates through pathway-specific response profiling. The approach is directly applicable to preclinical evaluation of immunomodulators and replication inhibitors in poxvirus-related therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host-pathogen interaction networks through time-course profiling of viral and host gene expression.
- Operational Value: Provides a standardized infection model for consistent target engagement assessment across compound screening campaigns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-stamped transcriptional readouts suitable for assay normalization and hit validation in antiviral screens.
- Operational Value: Establishes a reproducible RNA extraction workflow compatible with downstream amplification and microarray-based expression profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking viral gene classes (early, intermediate, late) to functional stages of the replication cycle.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between virology, genomics, and pharmacology teams through standardized temporal sampling.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, specifically supporting target validation and assay development stages prior to lead optimization in antiviral programs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of viral gene function and host response modulation through defined temporal infection windows.
- Screening: Produces standardized, high-quality RNA inputs for microarray-based expression analysis, ensuring assay reproducibility.
- Analytics: Delivers time-resolved gene expression measurements that allow comparison of transcriptional states across infection stages and treatment conditions.
- Translational Research: Connects in vitro infection dynamics to preclinical relevance by modeling poxvirus transcriptional programming.
- Enterprise Reuse: The core RNA extraction and time-course infection framework is adaptable to other enveloped DNA viruses, promoting platform reuse across antiviral projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by resolving temporal order of viral gene expression and associated host pathway modulation.
- Operational Value: Reduces variability in infection models through standardized MOI, synchronization, and RNA recovery procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing mechanistic insight into antiviral mechanism of action at the transcriptional level.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on early vs. late viral gene expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology biosafety protocols and aseptic technique for handling vaccinia virus.
- Depends on access to RNA isolation kits, centrifugation equipment, and spectrophotometry for RNA quantification and quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of time-point harvesting and infection timing to ensure data comparability.
- Adaptation to primary or immune cell lines may require optimization of infection conditions and virus titration.
- RNA yield sensitivity to over-drying during ethanol wash steps necessitates careful protocol adherence to maintain amplification compatibility.
