Name: 牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析:第2部分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 了解牛痘病毒感染HeLa细胞后通过逆转录合成cDNA并进行体外转录扩增病毒RNA的完整实验流程。该方法为病毒学与宿主基因表达微阵列分析提供可靠技术支持。

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怀特黑德研究所研究员基金

第一部分：从RNA合成cDNA
<ol>
<li>使用 Ambion Amino Allyl MessageAmp II 试剂盒之前，向洗涤缓冲液中加入推荐体积的100%乙醇。</li>
<li>在PCR反应管中，加入100 ng至5 µg总RNA和1 µl T7寡聚(dT)引物，用无核酸酶水将体积调至12 µl。</li>
<li>在70°C下孵育样本10分钟，使用PCR仪。</li>
<li>从70°C环境中取出RNA样品，短暂离心，置于冰上。</li>
<li>制备 1st 链合成预混液，室温保存（预留10%过量以补偿移液误差）。 （表1）</li>
<li>轻轻吹打混匀主混合液或轻轻振荡混匀，然后短暂离心。</li>
<li>将8µl的混合液转移至每个RNA样本中，用移液器轻轻吹打3-4次以混匀。</li>
<li>在42°C下孵育2小时，使用PCR仪。</li>
<li>短暂离心样品并置于冰上，立即进行双链DNA合成的下一步操作。</li>
<li>制备 2nd 链合成预混液置于冰上（额外增加10%以补偿移液误差）。 （表2）</li>
<li>轻轻吹打混匀主混合液或振荡混匀，然后短暂离心。</li>
<li>将80 µl转移至每个样品中，然后通过上下吹打3-4次轻轻混匀。</li>
<li>在PCR仪中于16°C孵育2小时。</li>
<li>孵育2小时后，立即进行cDNA纯化步骤，或在–20°C下速冻保存。</li>
</ol>
第二部分：双链 cDNA 纯化
<ol>
<li>从冰箱中取出cDNA纯化试剂，使用前于室温下平衡30分钟。使用前轻轻振荡瓶体，充分重悬磁性cDNA结合珠。</li>
<li>将无核酸酶水等分至1.5 mL离心管中，在前一步2小时孵育期间，于50–60°C孵育至少10分钟。</li>
<li>向每个样品中加入 180 µl cDNA Pure，通过反复移液充分混匀。将样品转移至 96 孔圆底板中。</li>
<li>继续在轨道摇床上轻轻振荡混匀样品，至少持续2分钟。</li>
<li>将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。将培养板留在磁力架上约6分钟，或直至混合液变得透明且结合用磁珠完全沉降。</li>
<li>使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，使用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>向每个孔中加入 150 µl cDNA 洗涤缓冲液，并在摇床上以中等速度振荡 1 分钟。由于洗涤缓冲液的表面张力较低，此步骤中磁珠不会分散。</li>
<li>将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。</li>
<li>使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>重复洗涤2次nd 用150µl cDNA洗涤缓冲液洗涤。</li>
<li>2分钟后nd 洗涤后，在旋涡振荡器上以最大速度振荡平板2分钟，使磁珠干燥。切勿过度干燥！</li>
<li>向每个样本中加入18 µl预热的无核酸酶水，从磁珠中洗脱cDNA。</li>
<li>在轨道摇床上剧烈振荡平板3分钟，然后检查磁珠是否完全分散。若未完全分散，则继续振荡。</li>
<li>磁珠完全分散后，将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。</li>
<li>小心地将洗脱的 cDNA（约 16 µl）转移至新的 PCR 板（或 PCR 管）中。</li>
<li>直接进入下一步，或将 cDNA 在 -20°C 冻存。 </li>
</ol>
第3部分：体外转录（IVT）
<ol>
<li>在室温下配制体外转录（IVT）主混合液。（表3）</li>
<li>轻轻吹打主混合液或轻弹管壁以混匀，并短暂离心。</li>
<li>向每个样品中加入24 µl，通过上下吹打3–4次轻轻混匀。</li>
<li>在热循环仪中37°C孵育14小时，随后保持在4°C，直至进行下一步操作。</li>
</ol>
第4部分：体外转录后aRNA的纯化
<ol>
<li>使用前将RNA结合磁珠短暂涡旋，以获得均匀的混合物。</li>
<li>在室温下配制 aRNA 结合混合液。 （表4） 这可以提前完成——制备好的结合混合液可在室温下保存长达一周。</li>
<li>充分涡旋混匀。</li>
<li>将aRNA洗脱缓冲液分装至1.5 mL离心管中，在50–60°C孵育至少10分钟。</li>
<li>向每个样本中加入70µl aRNA结合混合液，通过上下吹打3-4次充分混匀。</li>
<li>将样品从PCR板转移至96孔圆底板中。</li>
<li>向每个样品中加入50 µl 100%异丙醇，用移液器上下吹打3–4次以充分混匀。</li>
<li>在摇床上轻轻振荡平板，至少 2 分钟，以充分混匀样品。</li>
<li>将培养板置于磁力架上以捕获磁珠。保持培养板在磁力架上，直至混合物变得透明且结合磁珠完全沉降。</li>
<li>使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>向每个孔中加入100 µl aRNA洗涤液，在摇床上以中等速度振荡1分钟。此步骤中磁珠可能未完全分散。</li>
<li>将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。</li>
<li>使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>重复洗涤一次nd 用100 µl aRNA洗涤液洗涤。</li>
<li>2之后nd 洗涤后，在最大转速下将平板置于摇床上震荡1分钟以干燥珠子。切勿过度干燥样品！</li>
<li>向每个样本中加入40 µl预热的aRNA洗脱缓冲液，从磁珠中洗脱aRNA。</li>
<li>在轨道摇床上剧烈振荡平板3分钟，然后检查磁珠是否已充分分散。若未充分分散，则继续振荡。</li>
<li>磁珠完全分散后，将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。上清液中含有纯化后的氨基烯丙基标记的aRNA。</li>
<li>将洗脱的aRNA小心转移至新的PCR板（或PCR管）中。</li>
<li>（可选步骤）使用NanoDrop分光光度计测量1.5 µl样品以检测RNA浓度。</li>
<li>立即进入下一步操作，或将aRNA在–80°C保存。</li>
</ol>
表1：cDNA 1st 链合成预混液
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
<td>单次反应所需用量</td>
</tr>
<tr>
<td>10X First Strand Buffer</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
<td>1 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Array Script</td>
<td>1 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表 2：cDNA 2nd 链合成预混液
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
<td>单次反应所需用量</td>
</tr>
<tr>
<td>无核酸酶水</td>
<td>63 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>10X 第二链缓冲液</td>
<td>10 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP 混合液</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>DNA 聚合酶</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase H</td>
<td>1 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表3：体外转录主混合液
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
<td>单次反应所需用量</td>
</tr>
<tr>
<td>aaUTP 溶液 (75 mM)</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>ATP、CTP、GTP 混合液 (25 mM)</td>
<td>12 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>T7 UTP 溶液 (75 mM)</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>T7 10X 反应缓冲液</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>T7 酶混合液</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表4：aRNA结合反应体系
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
<td>单次反应所需用量</td>
</tr>
<tr>
<td>RNA 结合磁珠*</td>
<td>10 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>磁珠重悬液*</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>100% 异丙醇**</td>
<td>6 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>aRNA 结合缓冲液浓缩液</td>
<td>50 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
* 先将RNA结合磁珠与磁珠重悬液混合。 ** 加入异丙醇并充分混匀，然后再加入aRNA结合缓冲液浓缩液。

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

关键步骤
不建议进行第二轮扩增，因为已在芯片数据中观察到偏差。在每个酶促步骤中均需仔细混匀（1st 和 2nd cDNA合成和体外转录（IVT）是获得良好扩增产量的关键步骤，每个酶促反应步骤均需在适宜温度下孵育。建议使用带有可调节加热盖的PCR仪——即使在空气杂交炉或水浴杂交中，IVT过程中的温度偏差小至2–3摄氏度，也可能显著影响扩增产物的得率。
应用/意义
本方案产生的标记RNA可用于与人源、病毒或定制的微阵列杂交，以评估培养细胞在感染后的基因表达应答。微阵列平台各不相同，因此请遵循制造商的说明，由标记探针制备杂交混合液。
利用定制设计的痘病毒芯片1，我们能够根据杂交信号出现的时间以及转录本检测是否依赖病毒DNA复制，将基因分类为“早期”或“晚期”等大类。我们观察到每个时间类别中基因的预期功能类别（即预期的早期、中期和晚期基因），但在转录的确切时间...

<table><tbody><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒</td><td>试剂</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>适用于 20 次反应</td></tr><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒</td><td>试剂</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>适用于 100 次反应，96 孔板格式</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS 分光光度计</td><td>其他</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>或性能相当的分光光度计</td></tr></tbody></table>

痘苗病毒感染及病毒基因表达的时间分析：第二部分

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

该家族Poxviridae由大型双链DNA构成的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科成员包括orthopox属包括天花病毒（variola），即人类天花的病原体，猴痘病毒（monkeypox）以及痘苗病毒（vaccinia, VAC），后者是痘病毒科的典型代表。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但它们在病毒生命周期中各自发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主和病毒基因表达的调控机制，我们采用了全基因组方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了痘苗病毒感染HeLa细胞的时间过程实验，并在感染后多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。

HeLa细胞感染痘苗病毒及宿主与病毒基因表达分析的实验方案。第2部分（共3部分）。

痘病毒科（Poxviridae）由含有大型双链DNA的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科……

大家好，我是来自怀特黑德生物医学研究所 Kate Rubins 实验室的 Judy Yen。在用痘苗病毒侵染 HeLa 细胞并提取总 RNA 后（该步骤已在之前的 JoVE 视频文章中展示），可进一步分离病毒 RNA，并通过逆转录和体外转录进行扩增，扩增后的 RNA 将用于后续的微阵列分析，以研究病毒和宿主基因的表达情况。现在让我们开始吧。开始从RNA合成cDNA时，首先在使用环境氨基酸等位基因信息AMP 2试剂盒前，向洗涤缓冲液中加入推荐体积的100%乙醇。在PCR反应管中，加入100纳克至5微克的总RNA以及1微升T7寡核苷酸引物，再用无核酸酶水将反应体系补至12微升。将样品置于热循环仪中，在70摄氏度孵育10分钟。接下来，从70摄氏度的离心机中取出RNA样品。短暂离心后，将样品置于冰上。配制第一链合成预混液时，需额外增加10%体积，以弥补移液操作误差。室温下静置，轻轻用移液器吹打混匀主混合液或轻轻弹击管壁混匀，短暂离心后，取八微升主混合液加入各RNA样本中，通过上下吹打三至四次混匀，随后在42摄氏度下孵育两小时（使用PCR仪）。孵育结束后，将样本短暂离心，并立即置于冰上。随后立即进行双链cDNA合成的下一步操作。在冰上配制第二链合成预混液，额外增加10%体积以补偿移液误差。轻轻吹打混匀预混液或用手指轻弹管壁，短暂离心后，将80微升预混液转移至每个样品中，通过上下吹打3至4次轻轻混匀。在PCR仪中于16摄氏度孵育2小时。经过两小时孵育后，继续进行双链cDNA纯化步骤，或立即在零下20摄氏度冷冻保存。开始双链cDNA纯化前，首先从冰箱中取出cDNA纯化试剂盒，室温平衡30分钟后再使用；使用前轻轻振荡瓶体，充分重悬磁性cDNA结合珠。将无核酸酶水分装至1.5毫升离心管中，于50至60摄氏度孵育至少10分钟。在之前两小时的孵育过程中，向每个样品中加入180 µL的CD NA纯化液，并通过反复移液上下吹打充分混匀。将样品转移至96孔圆底板中。样品转移至板后，继续在旋转摇床上轻轻振荡至少两分钟以保持样品混合均匀。将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。将培养板留在磁力架上约六分钟，或直至混合物变得透明且结合用磁珠完全沉淀。使用真空抽吸装置小心地吸除上清液，注意不要扰动磁珠。或者，用移液器小心吸去上清液并弃去。弃去上清液后，将板从磁架上取下。随后向每孔加入150 µL cDNA洗涤缓冲液，并在摇床中以中等速度振荡1分钟。由于洗涤缓冲液的表面张力较低，此步骤中磁珠不会分散。振荡后，将培养板放回磁力架上。为捕获磁珠，请使用真空吸液器小心吸除上清液，注意不要扰动磁珠。或用移液器小心吸去上清液，并弃去上清液。将反应板从磁力架上取下。用150 µL cDNA洗涤缓冲液重复洗涤第二次。第二次洗涤后，在最大转速下将酶标板置于摇床上震荡两分钟，使磁珠干燥。注意不要让磁珠过度干燥。接下来，向

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