Name: 牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析:第2部分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 了解牛痘病毒感染HeLa细胞后通过逆转录合成cDNA并进行体外转录扩增病毒RNA的完整实验流程。该方法为病毒学与宿主基因表达微阵列分析提供可靠技术支持。

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怀特黑德研究所研究员基金

第一部分：从RNA合成cDNA
<ol>
<li>使用 Ambion Amino Allyl MessageAmp II 试剂盒之前，向洗涤缓冲液中加入推荐体积的100%乙醇。</li>
<li>在PCR反应管中，加入100 ng至5 µg总RNA和1 µl T7寡聚(dT)引物，用无核酸酶水将体积调至12 µl。</li>
<li>在70°C下孵育样本10分钟，使用PCR仪。</li>
<li>从70°C环境中取出RNA样品，短暂离心，置于冰上。</li>
<li>制备 1st 链合成预混液，室温保存（预留10%过量以补偿移液误差）。 （表1）</li>
<li>轻轻吹打混匀主混合液或轻轻振荡混匀，然后短暂离心。</li>
<li>将8µl的混合液转移至每个RNA样本中，用移液器轻轻吹打3-4次以混匀。</li>
<li>在42°C下孵育2小时，使用PCR仪。</li>
<li>短暂离心样品并置于冰上，立即进行双链DNA合成的下一步操作。</li>
<li>制备 2nd 链合成预混液置于冰上（额外增加10%以补偿移液误差）。 （表2）</li>
<li>轻轻吹打混匀主混合液或振荡混匀，然后短暂离心。</li>
<li>将80 µl转移至每个样品中，然后通过上下吹打3-4次轻轻混匀。</li>
<li>在PCR仪中于16°C孵育2小时。</li>
<li>孵育2小时后，立即进行cDNA纯化步骤，或在–20°C下速冻保存。</li>
</ol>
第二部分：双链 cDNA 纯化
<ol>
<li>从冰箱中取出cDNA纯化试剂，使用前于室温下平衡30分钟。使用前轻轻振荡瓶体，充分重悬磁性cDNA结合珠。</li>
<li>将无核酸酶水等分至1.5 mL离心管中，在前一步2小时孵育期间，于50–60°C孵育至少10分钟。</li>
<li>向每个样品中加入 180 µl cDNA Pure，通过反复移液充分混匀。将样品转移至 96 孔圆底板中。</li>
<li>继续在轨道摇床上轻轻振荡混匀样品，至少持续2分钟。</li>
<li>将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。将培养板留在磁力架上约6分钟，或直至混合液变得透明且结合用磁珠完全沉降。</li>
<li>使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，使用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>向每个孔中加入 150 µl cDNA 洗涤缓冲液，并在摇床上以中等速度振荡 1 分钟。由于洗涤缓冲液的表面张力较低，此步骤中磁珠不会分散。</li>
<li>将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。</li>
<li>使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>重复洗涤2次nd 用150µl cDNA洗涤缓冲液洗涤。</li>
<li>2分钟后nd 洗涤后，在旋涡振荡器上以最大速度振荡平板2分钟，使磁珠干燥。切勿过度干燥！</li>
<li>向每个样本中加入18 µl预热的无核酸酶水，从磁珠中洗脱cDNA。</li>
<li>在轨道摇床上剧烈振荡平板3分钟，然后检查磁珠是否完全分散。若未完全分散，则继续振荡。</li>
<li>磁珠完全分散后，将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。</li>
<li>小心地将洗脱的 cDNA（约 16 µl）转移至新的 PCR 板（或 PCR 管）中。</li>
<li>直接进入下一步，或将 cDNA 在 -20°C 冻存。 </li>
</ol>
第3部分：体外转录（IVT）
<ol>
<li>在室温下配制体外转录（IVT）主混合液。（表3）</li>
<li>轻轻吹打主混合液或轻弹管壁以混匀，并短暂离心。</li>
<li>向每个样品中加入24 µl，通过上下吹打3–4次轻轻混匀。</li>
<li>在热循环仪中37°C孵育14小时，随后保持在4°C，直至进行下一步操作。</li>
</ol>
第4部分：体外转录后aRNA的纯化
<ol>
<li>使用前将RNA结合磁珠短暂涡旋，以获得均匀的混合物。</li>
<li>在室温下配制 aRNA 结合混合液。 （表4） 这可以提前完成——制备好的结合混合液可在室温下保存长达一周。</li>
<li>充分涡旋混匀。</li>
<li>将aRNA洗脱缓冲液分装至1.5 mL离心管中，在50–60°C孵育至少10分钟。</li>
<li>向每个样本中加入70µl aRNA结合混合液，通过上下吹打3-4次充分混匀。</li>
<li>将样品从PCR板转移至96孔圆底板中。</li>
<li>向每个样品中加入50 µl 100%异丙醇，用移液器上下吹打3–4次以充分混匀。</li>
<li>在摇床上轻轻振荡平板，至少 2 分钟，以充分混匀样品。</li>
<li>将培养板置于磁力架上以捕获磁珠。保持培养板在磁力架上，直至混合物变得透明且结合磁珠完全沉降。</li>
<li>使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>向每个孔中加入100 µl aRNA洗涤液，在摇床上以中等速度振荡1分钟。此步骤中磁珠可能未完全分散。</li>
<li>将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。</li>
<li>使用真空抽吸装置小心吸出上清液，避免扰动磁珠。或者，用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>重复洗涤一次nd 用100 µl aRNA洗涤液洗涤。</li>
<li>2之后nd 洗涤后，在最大转速下将平板置于摇床上震荡1分钟以干燥珠子。切勿过度干燥样品！</li>
<li>向每个样本中加入40 µl预热的aRNA洗脱缓冲液，从磁珠中洗脱aRNA。</li>
<li>在轨道摇床上剧烈振荡平板3分钟，然后检查磁珠是否已充分分散。若未充分分散，则继续振荡。</li>
<li>磁珠完全分散后，将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。上清液中含有纯化后的氨基烯丙基标记的aRNA。</li>
<li>将洗脱的aRNA小心转移至新的PCR板（或PCR管）中。</li>
<li>（可选步骤）使用NanoDrop分光光度计测量1.5 µl样品以检测RNA浓度。</li>
<li>立即进入下一步操作，或将aRNA在–80°C保存。</li>
</ol>
表1：cDNA 1st 链合成预混液
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
<td>单次反应所需用量</td>
</tr>
<tr>
<td>10X First Strand Buffer</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Ribonuclease Inhibitor</td>
<td>1 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>Array Script</td>
<td>1 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表 2：cDNA 2nd 链合成预混液
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
<td>单次反应所需用量</td>
</tr>
<tr>
<td>无核酸酶水</td>
<td>63 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>10X 第二链缓冲液</td>
<td>10 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP 混合液</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>DNA 聚合酶</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase H</td>
<td>1 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表3：体外转录主混合液
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
<td>单次反应所需用量</td>
</tr>
<tr>
<td>aaUTP 溶液 (75 mM)</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>ATP、CTP、GTP 混合液 (25 mM)</td>
<td>12 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>T7 UTP 溶液 (75 mM)</td>
<td>2 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>T7 10X 反应缓冲液</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>T7 酶混合液</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表4：aRNA结合反应体系
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
<td>单次反应所需用量</td>
</tr>
<tr>
<td>RNA 结合磁珠*</td>
<td>10 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>磁珠重悬液*</td>
<td>4 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>100% 异丙醇**</td>
<td>6 µl</td>
</tr>
<tr>
<td>aRNA 结合缓冲液浓缩液</td>
<td>50 µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
* 先将RNA结合磁珠与磁珠重悬液混合。 ** 加入异丙醇并充分混匀，然后再加入aRNA结合缓冲液浓缩液。

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

关键步骤
不建议进行第二轮扩增，因为已在芯片数据中观察到偏差。在每个酶促步骤中均需仔细混匀（1st 和 2nd cDNA合成和体外转录（IVT）是获得良好扩增产量的关键步骤，每个酶促反应步骤均需在适宜温度下孵育。建议使用带有可调节加热盖的PCR仪——即使在空气杂交炉或水浴杂交中，IVT过程中的温度偏差小至2–3摄氏度，也可能显著影响扩增产物的得率。
应用/意义
本方案产生的标记RNA可用于与人源、病毒或定制的微阵列杂交，以评估培养细胞在感染后的基因表达应答。微阵列平台各不相同，因此请遵循制造商的说明，由标记探针制备杂交混合液。
利用定制设计的痘病毒芯片1，我们能够根据杂交信号出现的时间以及转录本检测是否依赖病毒DNA复制，将基因分类为“早期”或“晚期”等大类。我们观察到每个时间类别中基因的预期功能类别（即预期的早期、中期和晚期基因），但在转录的确切时间...

<table><tbody><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒</td><td>试剂</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>适用于 20 次反应</td></tr><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA 扩增试剂盒</td><td>试剂</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>适用于 100 次反应，96 孔板格式</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS 分光光度计</td><td>其他</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>或性能相当的分光光度计</td></tr></tbody></table>

痘苗病毒感染及病毒基因表达的时间分析：第二部分

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

该家族Poxviridae由大型双链DNA构成的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科成员包括orthopox属包括天花病毒（variola），即人类天花的病原体，猴痘病毒（monkeypox）以及痘苗病毒（vaccinia, VAC），后者是痘病毒科的典型代表。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但它们在病毒生命周期中各自发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主和病毒基因表达的调控机制，我们采用了全基因组方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了痘苗病毒感染HeLa细胞的时间过程实验，并在感染后多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。

HeLa细胞感染痘苗病毒及宿主与病毒基因表达分析的实验方案。第2部分（共3部分）。

痘病毒科（Poxviridae）由含有大型双链DNA的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。该科……

大家好，我是来自怀特黑德生物医学研究所 Kate Rubins 实验室的 Judy Yen。在用痘苗病毒侵染 HeLa 细胞并提取总 RNA 后（该步骤已在之前的 JoVE 视频文章中展示），可进一步分离病毒 RNA，并通过逆转录和体外转录进行扩增，扩增后的 RNA 将用于后续的微阵列分析，以研究病毒和宿主基因的表达情况。现在让我们开始吧。开始从RNA合成cDNA时，首先在使用环境氨基酸等位基因信息AMP 2试剂盒前，向洗涤缓冲液中加入推荐体积的100%乙醇。在PCR反应管中，加入100纳克至5微克的总RNA以及1微升T7寡核苷酸引物，再用无核酸酶水将反应体系补至12微升。将样品置于热循环仪中，在70摄氏度孵育10分钟。接下来，从70摄氏度的离心机中取出RNA样品。短暂离心后，将样品置于冰上。配制第一链合成预混液时，需额外增加10%体积，以弥补移液操作误差。室温下静置，轻轻用移液器吹打混匀主混合液或轻轻弹击管壁混匀，短暂离心后，取八微升主混合液加入各RNA样本中，通过上下吹打三至四次混匀，随后在42摄氏度下孵育两小时（使用PCR仪）。孵育结束后，将样本短暂离心，并立即置于冰上。随后立即进行双链cDNA合成的下一步操作。在冰上配制第二链合成预混液，额外增加10%体积以补偿移液误差。轻轻吹打混匀预混液或用手指轻弹管壁，短暂离心后，将80微升预混液转移至每个样品中，通过上下吹打3至4次轻轻混匀。在PCR仪中于16摄氏度孵育2小时。经过两小时孵育后，继续进行双链cDNA纯化步骤，或立即在零下20摄氏度冷冻保存。开始双链cDNA纯化前，首先从冰箱中取出cDNA纯化试剂盒，室温平衡30分钟后再使用；使用前轻轻振荡瓶体，充分重悬磁性cDNA结合珠。将无核酸酶水分装至1.5毫升离心管中，于50至60摄氏度孵育至少10分钟。在之前两小时的孵育过程中，向每个样品中加入180 µL的CD NA纯化液，并通过反复移液上下吹打充分混匀。将样品转移至96孔圆底板中。样品转移至板后，继续在旋转摇床上轻轻振荡至少两分钟以保持样品混合均匀。将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。将培养板留在磁力架上约六分钟，或直至混合物变得透明且结合用磁珠完全沉淀。使用真空抽吸装置小心地吸除上清液，注意不要扰动磁珠。或者，用移液器小心吸去上清液并弃去。弃去上清液后，将板从磁架上取下。随后向每孔加入150 µL cDNA洗涤缓冲液，并在摇床中以中等速度振荡1分钟。由于洗涤缓冲液的表面张力较低，此步骤中磁珠不会分散。振荡后，将培养板放回磁力架上。为捕获磁珠，请使用真空吸液器小心吸除上清液，注意不要扰动磁珠。或用移液器小心吸去上清液，并弃去上清液。将反应板从磁力架上取下。用150 µL cDNA洗涤缓冲液重复洗涤第二次。第二次洗涤后，在最大转速下将酶标板置于摇床上震荡两分钟，使磁珠干燥。注意不要让磁珠过度干燥。接下来，向每个样本中加入18 µL预热的无核酸酶水，并充分振荡，以将cDNA从磁珠上洗脱下来。在摇床上震荡培养板三分钟。然后检查磁珠是否已完全分散。若未完全分散，则继续震荡。当磁珠完全分散后，将酶标板移至磁力架上。为捕获磁珠，小心地将洗脱出的cdNA转移至新的PCR板或PCR管中。每份应可回收约16微升的洗脱液。可直接进入下一步，或将cDNA在-20摄氏度下冷冻保存。在室温下配制体外转录（IVT）主混合液。轻轻吹打混匀主混合液或用手指轻弹管壁混匀，然后短暂离心。离心后，向每个样品中加入24 µL，用移液器轻轻吹打3到4次混匀，在热循环仪中于37 °C孵育14小时。然后置于4 °C保存，待进行下一步操作。使用前将RNA结合磁珠短暂涡旋振荡，以获得均匀混合物。在室温下配制A RNA结合混合液。此步骤可预先完成。制备好的结合混合液可在室温下保存长达一周。将A RNA洗脱缓冲液分装至1.5毫升离心管中，充分涡旋混匀，并在50至60摄氏度孵育至少10分钟。现在，向每个样本中加入 70 µL 的 A RNA 结合液，通过上下吹打 3 至 4 次充分混匀。将样本从 PCR 板转移至 96 孔圆底板中。接着，向每个样本中加入 50 µL 的 100% 异丙醇，通过上下吹打 3 至 4 次充分混匀。在旋转摇床上轻轻振荡平板至少两分钟。为充分混匀样品，将平板转移至磁力架上，以捕获磁珠。将平板置于支架上，直至混合物变得透明且结合珠完全沉淀。待珠子沉淀后，用真空吸液器小心吸除上清液，注意不要扰动磁珠。或者，也可用移液枪小心吸取上清液并弃去。从磁力架上取下反应板。接着，向每个孔中加入100 µL RNA洗涤液，并在摇床上以中等速度振荡反应板1分钟。此过程中，磁珠无需完全分散。此步骤完成后，将反应板移回磁力架上。为捕获磁珠。使用真空抽吸装置小心抽吸上清液，注意不要扰动磁珠。或者，也可使用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。去除上清液后，将培养板从磁力架上取下。用 100 微升 RNA 洗涤液重复洗涤一次。第二次洗涤后，在轨道摇床上以最大速度振荡培养板一分钟，使磁珠干燥。注意不要将样本过度干燥，通过向每个样本中加入 40 µL 预热的 A RNA 洗脱缓冲液，从磁珠中洗脱 A RNA。将板子在旋转摇床上剧烈振荡 3 分钟。然后检查确认磁珠已完全分散。如果没有完全分散，则继续震荡。一旦磁珠完全分散，将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。上清液中含有经纯化的氨基等位基因，并已整合了RNA。小心地将洗脱的RNA转移至新的PCR板或PCR管中。此时，可通过在NanoDrop分光光度计上测量1.5 µL来检测样品的RNA浓度。随后立即进行下一步操作，或将RNA于-80°C保存。我们刚刚向您展示了如何对用于微阵列杂交的扩增免疫等位基因掺入RNA样本进行荧光标记。在进行此操作时，需要注意不建议进行第二轮扩增。由于已观察到存在偏差和阵列数据异常，因此还需注意在每个酶促反应步骤中均应仔细混匀，包括第一链和第二链的合成过程。互补DNA合成或体外转录（IVT）步骤对于获得良好的扩增产量至关重要，每个酶促反应步骤在适宜温度下的孵育也同样重要。建议使用带有可调节加热盖的PCR仪，因为在体外转录过程中，即使使用空气杂交炉或水浴进行杂交时温度偏差仅有两到三度，也可能显著影响扩增产物的产量。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。请务必观看本系列中的其他视频，我们将演示如何进行痘苗病毒感染的时间进程实验、样本的RNA提取，以及荧光标记RNA的制备与纯化。

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