Name: 测量中使用FM标签的神经元的胞外分泌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学习使用FM 4-64荧光染料实时成像技术测量海马神经元突触小泡释放动力学的方法。该技术可深入解析神经递质释放机制，为神经科学研究提供可靠的囊泡动态可视化手段。

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细胞：大鼠（或小鼠）原代海马神经元培养物（体外培养14-28天）。
刺激：通过两个铂电极进行电刺激；70-90 mV
显微镜技术：倒置CCD荧光显微镜配备60倍油镜。
软件：Slidebook（Intelligent Imaging Innovations，美国加利福尼亚州圣莫尼卡）
详见补充方法页面
<ol>
<li>将 HEPES 缓冲盐水（HBS）升温至室温。&nbsp; 加入谷氨酸受体拮抗剂 APV（终浓度 50 µM）和 CNQX（终浓度 10 µM）。&nbsp; 每次 FM 实验通常需要 20–30 mL HBS。配制 10 µM FM 4-64（Molecular Probes）工作液时，将储备液用含拮抗剂的 HBS 稀释 1000 倍。&nbsp; 每次实验配制 2 mL FM 溶液。用铝箔覆盖溶液以避免光照。 </li>
<li>将含有神经元的盖玻片安装到电极腔室中。&nbsp; 检查腔室中的培养基液面是否与腔室顶部齐平，并完全覆盖电极。&nbsp; 清除盖玻片底部多余的液体。如使用油镜，则在物镜上添加镜油。 </li>
<li>设置灌流装置。&nbsp; 首先按以下顺序依次用几毫升液体冲洗（每种液体充分流过后再加入下一种）：水、乙醇、水，然后是 HBS。接着加入 HBS（保留几毫升用于后续手动添加），并关闭灌流系统。&nbsp; 将灌流出口和吸液管分别置于盖玻片两侧边缘。&nbsp; 灌流出口应伸入腔室内，而吸液管应置于最上方。&nbsp; 在加入 HBS（无论是通过灌流还是手动添加）时，打开吸液并调整其位置，使培养基液面保持在刚好完全覆盖电极的水平。 </li>
<li>在盖玻片上寻找希望成像的区域，并大致调焦。&nbsp; 理想区域应含有大量突触，但密度不宜过高，以免单个结构难以分辨。&nbsp; 区域内应无或仅有极少的细胞体、非特异性膜结构（如星形胶质细胞团块）或其他非特异性物质（如棉絮）。&nbsp; FM 染料可能非特异性地吸附在这些物质上。 </li>
<li>使用“WG”滤光立方体（以绿光激发，收集红光至远红光发射信号）。&nbsp; 在 Slideview 中设置“采集偏好”，使图像 0 开始时给予 900 个动作电位（AP），频率为 10 Hz（通常此加载刺激使用 300 至 900 个动作电位）。在图像窗口中选择“fluo-vis-red”滤光设置，并将曝光时间调整为 100 ms。&nbsp; 关闭任何已存在的延时成像设置。在准备开始刺激前，不要进行任何图像采集。 </li>
<li>确保吸液已开启。迅速将 FM 溶液（2 mL）加至吸液端对侧的腔室中。&nbsp; 立即在图像窗口中点击“确定”以采集图像并开始刺激。刺激结束后等待 30–45 秒，然后快速加入约 2 mL HBS 洗去 FM 染料（我通常用手持移液器操作，但也可通过灌流完成）。 </li>
<li>通过灌流用 HBS 洗涤 FM 染料约 10 分钟。&nbsp; 灌流速率应为 1–1.5 mL/min。在此洗涤过程中，更改刺激设置，使刺激在图像 10 开始（通常此去染色刺激使用 900 至 1200 个动作电位，频率为 10 Hz）。约在洗涤进行至 7 分钟时，再次检查设置（确保刺激在图像 10 开始）。&nbsp; 现在使用小范围对焦窗口选择并聚焦一个子区域。确保在进入下一步前已更改刺激设置。采集单张图像以判断洗涤是否完全（单个突触应呈现清晰的点状结构）。&nbsp; 若未完全洗净，将流速额外提高 0.5 mL/min，并再等待 2 分钟。 </li>
<li>洗涤完成后，根据需要调整曝光时间，以获得良好且清晰的信号（通常为 50–100 ms）。由于 FM 染料光漂白迅速，应尽量缩短曝光时间。然后设置延时成像参数，每 5 秒采集 38 张图像。&nbsp; 检查灌流系统，确保有足够的 HBS 维持至少再灌流 5 分钟，并保持灌流持续进行。&nbsp; 启动延时成像以开始去染色过程。 </li>
<li>去染色完成后，更改刺激设置，使图像 0 开始时给予 1200 个动作电位（10 Hz）（此最后步骤通常使用 1200 至 2000 个动作电位）。&nbsp; 关闭延时成像设置，采集单张图像以启动刺激。灌流应继续保持流动。&nbsp; 此步骤有助于清除残留的囊泡内 FM 染料，以确定背景荧光或“总可释放”荧光水平。&nbsp; 刺激结束后，关闭刺激设置，重新对焦目标区域。&nbsp; 关闭灌流和吸液，然后采集两张最终的背景图像。&nbsp; 可采集单张图像或 Z 层扫描图像（步长 0.5 µm）。&nbsp; Z 层扫描有助于校正实验过程中焦平面的偏移。 </li>
<li>您的 FM 实验已完成。&nbsp; 若立即进行更多实验，每次实验之间应清洁物镜和腔室，但灌流装置可等到所有实验结束后再清洗。&nbsp; 彻底用水冲洗装置，然后用乙醇冲洗。</li>
</ol>

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于300个动作电位（APs）足以诱导至少一轮囊泡再循环，因此通常给予300个或更多的动作电位作为加载刺激，以标记再循环池中的囊泡。尽管更强的加载刺激（如900个APs）可能使少量额外的囊泡被标记，但这也会增加染料嵌入细胞外膜的时间，导致非特异性染色增强。我发现清洗步骤对于实现适当的脱染至关重要。灌流时流速应保持在每分钟1至1.5 mL，通常持续10 ± 2分钟。可在清洗开始约7分钟时采集单幅图像，以监测染料去除的程度。如有必要，可略微提高流速或延长清洗时间。在我们的实验中，清洗时间超过10至12分钟是不可取的，因为这会增加囊泡标记因自发胞吐事件而丢失的可能性，即使细胞处于静息状态时也可能发生此类事件。在脱染步骤中，施加900至1200个APs以释放所有被标记的囊泡。此外，通常再施加1200至2000个APs，以获得“可释放荧光”的基线值，用于对脱染数据进行归一化处理。

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T-3166</td><td></td></tr><tr><td>CNQX 二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-239</td><td></td></tr></tbody></table>

使用fm染料标记法测量神经元中的胞吐作用

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

测量囊泡释放动力学的能力有助于深入了解神经传递的一些基本机制。本实验中，我们采用FM染料标记囊泡的实时成像技术，监测突触前囊泡释放速率。FM4-64是一种红色荧光亲脂性苯乙烯类染料，在胞吞作用被激活时可嵌入突触囊泡膜中。由于与脂质的相互作用，该染料在结合囊泡时荧光显著增强，发出明亮信号，而在细胞外液中则仅有微弱荧光。在通过洗涤步骤去除质膜外多余染料后，残留的FM染料主要集中于囊泡内部；当再次施加电刺激诱导胞吐作用时，染料随囊泡内容物一同释放。囊泡释放速率通过荧光信号的下降速率进行测定。由于FM染料可在体外短暂施加，因此是测定神经元培养物中胞吐速率的有效工具，尤其适用于比较转染突触与邻近对照突触小结之间的释放速率。

关键词：囊泡释放动力学，神经传递，FM染料成像，FM4-64，胞吞作用，胞吐作用，突触前囊泡，荧光信号，神经元培养，电刺激

测量囊泡释放动力学的能力有助于深入了解神经传递的一些基本机制。在此，我们利用红色荧光染料FM 4-64标记囊泡，并通过实时成像技术来测定海马神经元培养物中突触前囊泡的释放速率。

使用FM染料标记法测量神经元中的胞吐作用

测量囊泡释放动力学的能力有助于深入了解神经传递的一些基本机制。在此，我们使用了实时……

我是Jimmy Lynn。我是哈佛大学分子与细胞生物学项目的一名研究生。我目前在Murphy实验室工作，我们在实验室中研究海马体神经元。现在我将向您演示如何进行FM染料实验。接下来，我们将把载有神经元的盖玻片安装到这个定制的灌流槽中。我们的显微镜为倒置式，配备CCD相机，务必彻底擦干盖玻片底部。不要连接电极。不要。现在灌流系统已设置好，我将它放置在腔室的一端。我们使用黏土进行固定。每次实验的哈佛商学院（HBS）负责人将提前添加所有成分。融合体系已建立。需要使用琼脂糖来固定样本。此处区域含有细胞体，因为细胞体的膜会吸附大量染料，从而在突触部位产生较强的信号。可以选择邻近的区域，例如此处，我们立即开始成像。因此，前10幅图像将用于初始的光漂白。接下来介绍一下我自己，我是贾米尔·牛顿（Jamil Newton），哈佛大学分子生物学项目的一名研究生。目前我在神经科学实验室工作，我的导师是文基·墨菲（Vinky Murphy）。今天我想和大家讨论的是如何进行FM实验。那么，您的实验目标是什么？FM实验的优点在于，FM是一种荧光染料，能够让我们追踪胞吐作用的动力学过程。首先，我们通过给予加载刺激，确保染料被摄入突触。然后经过一段洗涤期后，再给予滞留刺激，使染料从囊泡中释放出来。您正在研究特定类型的神经元吗？因此，在我们的实验室中，我们对海马神经元使用这种方法，并将其应用于培养的神经元中，而不是裂解液中。该实验可能存在哪些问题？其中一些常见问题与我们所使用的电刺激有关。过去有时由于某些原因，电刺激在使用中会出现问题。我知道其他实验室也会使用高钾溶液。因此，如果电刺激存在问题，高钾溶液可以作为一个很好的替代方案。此外，通常情况下，在洗涤步骤中，无论出于何种原因，似乎都无法充分去除非特异性染色。我经常发现，只需提高流速，例如将每分钟0.5 ml增加到每分钟1.5 ml，并将洗涤时间从5分钟延长至10分钟，即可显著改善实验结果。该实验可能有哪些应用？你真正想要研究的是什么？好的，你可以利用它来检测对照细胞与经过某种处理的细胞之间的差异。例如，使用不同品系的小鼠，你可以观察其释放动力学是否存在差异，或者加入某种特定药物后，是否会影响胞吞作用。谢谢。

measuring-exocytosis-in-neurons-using-fm-labeling

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

测量中使用FM标签的神经元的胞外分泌

一种利用荧光多巴胺类似物光学测量神经传递的新方法。...

在单个突触前末梢通过FFN可视化多巴胺释放

介绍了一种活体荧光成像技术，用于定量中枢神经末梢中特定突触小泡（SV）池的补充与动员过程。在同一神经末梢中监测两轮SV循环，以提供内部对照。...

使用FM染料对培养的小脑颗粒神经元中突触囊泡池再补充进行定量分析

荧光染料的逆行运输可根据解剖投射标记特定神经元亚群。标记的轴突可进行可视化靶向 体内，允许对已识别的轴突进行细胞外记录。当神经元无法通过基因操作进行标记或难以使用“盲法”分离时，该技术有助于实现记录 体内...

逆行荧光标记可实现对已鉴定神经元的靶向细胞外单单位记录 体内

微电极介导的FM染料加载与卸载 果蝇 幼虫神经细胞

我们介绍了使用苯乙烯基FM染料对功能性神经末梢中的突触囊泡循环进行成像的方法。该方案不仅适用于诱发性突触活动，还可用于自发性和微小突触活动的检测。本方案拓展了可有效评估的突触事件类型。<br...

利用FM染料检测诱发性、自发性和微小突触活动期间的突触囊泡再循环

本文介绍了一种利用突触小泡蛋白2-pHluorin构建体和全内反射荧光显微镜技术研究神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态的方法。同时报道了图像处理与数据分析的策略。...

使用TIRFM和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态：细胞成像与数据分析

本文介绍了一种新型制备方法，用于在使用苯乙烯基吡啶鎓染料进行染色和脱色过程中，对支配小鼠耳部皮肤毛囊的梭形感觉末梢的板状末梢进行活体成像。...

活体毛囊梭形末梢神经末梢标记的光学监测 离体 小鼠耳部皮肤

通过将突触小泡蛋白与pHluorin融合后的光学显微镜检测以及突触小泡摄取的电子显微镜观察，可检测突触小泡的内吞作用。...

在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用

体积是反映细胞生理与病理特征的重要参数。我们介绍一种荧光排阻法，可实现全场范围的体积测量 体外...

利用荧光排阻法及专用微流控装置实现神经元的高分辨率体积成像

突触小泡（SV）循环是神经元突触处细胞间通讯的核心机制。FM染料的摄取与释放是定量检测SV内吞和外吐的主要方法。本文中，我们比较了在果蝇（Drosophila）神经肌肉接头（NMJ）模型突触上驱动FM1-43循环的所有刺激方法。...

突触处的FM染料循环：高钾去极化、电刺激与光敏通道蛋白刺激的比较

学习使用FM 4-64荧光染料实时成像技术测量海马神经元突触小泡释放动力学的方法。该技术可深入解析神经递质释放机制，为神经科学研究提供可靠的囊泡动态可视化手段。

使用FM染料标记法测量神经元中的胞吐作用

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