牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析:第3部分

大家好，我是来自怀特黑德生物医学研究所 Kate Rubins 实验室的 Judy Y。在这里，我们演示了如何通过染料的氨基全 LEO 偶联标记从牛痘病毒感染的 hela 细胞和病毒中收集的反义 RNA 样品。然后，我们展示了如何纯化标记的 A RNA 并准备将其杂交以进行基因表达的微阵列分析。

之前的 Joe 视频重点介绍了如何进行病毒感染、总 RNA 分离以及 RNA 扩增和扩增步骤。那么让我们开始吧。要开始 RNA 标记，首先将 1 微克 A RNA 样品加入 1.5 毫升微量离心管中。

用小火或无火真空干燥样品，直到它们完全干燥。每根试管干燥后立即加盖。重要的是，样品干燥后不要过度干燥。

向每管中加入 9 μL 偶联缓冲液，轻轻涡旋 1 分钟，短暂离心以收集试管底部的样品，然后让样品置于冰上，从而重悬 A RNA。接下来，向每管 SCI 3 或 S 5 染料中加入 22 μL 高质量 DMSO，一管染料足以用于两个样品。S SI 三个模具用于标记您的参考样品，SCI 五个染料用于标记您的测试样品。

涡旋染料以充分混合。请记住将染料放在黑暗中，直到准备好使用。请勿在使用前一小时之前制备染料，并确保任何时候都没有水进入染料 DMSO 混合物。

现在，将制备的 D-M-S-O-S 染料混合物加入每个样品中，通过涡旋充分混合。在室温下轻轻孵育 30 至 45 分钟。用锡纸盖住样品或将它们放在抽屉中，以尽量减少暴露在光线下。

4.5 μL 羟基胺中孵育后，向每个样品中加入羟基胺以淬灭反应，涡旋混合均匀。轻轻孵育 15 分钟的扫帚温度。用锡纸盖住样品或将它们放在抽屉中，以尽量减少暴露在光线下。

为了清洁标签，他们 RNA 涡旋，RNA 结合珠。为了在使用前获得均匀的混合物，请在室温下制备 A RNA 结合混合物。将 A RNA 洗脱缓冲液涡旋分装到 1.5 mL 试管中，并在 50 至 60 摄氏度下孵育至少 10 分钟，将结合混合物充分混合。

向每个样品中加入 70 微升 A RNA 结合混合物，混合后通过管道上下添加 3 至 4 次充分混合，将样品从 PCR 板转移到 96 孔圆底板中。接下来，向每个样品中加入 50 微升 100% 异丙醇，并通过上下吹打 3 到 4 次充分混合。在轨道摇床上轻轻摇动板至少两分钟。

彻底混合样品。将板移动到磁力架上。捕获磁珠。

将板放在支架上，直到混合物变得透明并且结合珠沉淀。用真空吸液器小心吸出上清液，不要干扰磁珠。或者，用移液管小心地去除上清液并丢弃上清液。

由于染料分子未掺入，此时上清液应为亮粉色或亮蓝色。丢弃上清液后，从磁力架上取下板。现在向每个孔中加入 100 μL RNA 洗涤液，并在定轨摇床上以中等速度摇动板 1 分钟。

在此步骤中，磁珠可能无法完全分散，请将板放回磁力架上。捕获磁珠。用真空吸液器小心吸出上清液，不要干扰磁珠。

或者，用移液管小心地去除上清液并丢弃上清液。从磁力架上取下板。用 100 μL RNA 洗涤液重复第二次洗涤。

第二次洗涤后。在轨道摇床上以最大速度摇动板 1 分钟，使珠子干燥。不要过度干燥样品，通过添加 20 μL 预热的 A RNA 洗脱缓冲液从磁珠中洗脱 A RNA。

对于每个样品，在轨道摇床上用力摇晃板 3 分钟。然后检查以确保磁珠完全分散。如果没有，请继续摇晃。

磁珠完全分散后，将磁珠板移至磁力架上以捕获磁珠。上清液包含纯化的标记的 A RNA 样品，应为淡粉色或淡蓝色。接下来，小心地将提到的 RNA 转移到新的 PCR 板或 PCR 管中。

此时，您可以通过在 NanoDrop 分光光度计上测量 1.5 μL 来检查样品中的 RNA 浓度和染料量。使用微阵列芯片模块，立即将标记的 A RNA 杂交到您选择的微阵列芯片平台上。或者，您可以将标记的 A RNA 储存在负 80 摄氏度，直到您准备好进行杂交。

这是使用 NanoDrop 分光光度计生成的代表性分光光度计读数和 OD 图，用于测量样品浓度和染料掺入。您可以看到 260 纳米处的 OD 峰用于计算样品的浓度，以及 532 纳米和 635 纳米附近的两个峰，分别代表 S3 和 SCI 五种染料。我们刚刚向您展示了如何对扩增的免疫等位基因掺入的 RNA 样品进行荧光标记，用于微射线杂交。

执行此程序时，请务必记住在偶联前不到一小时将染料重悬于 DMSO 中，并确保没有水进入染料 DMSO 混合物，因为它会与染料上的活性基团发生反应。同样重要的是要记住，如有必要，不要过度干燥 RNA。样品可以干燥至 1 至 2 μL，而不是完全干燥，然后在偶联反应期间充分重悬于偶联缓冲液中。

将反应保存在黑暗中，如果需要，偶尔轻弹和降低转速。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。

请务必观看本系列中的其他视频，在这些视频中，我们将展示如何对牛痘病毒进行时程感染和样品的 RNA 提取，以及 RNA 样品的线性扩增程序。