Name: 牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析:第3部分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习使用氨基烯丙基染料偶联法对牛痘病毒感染的HeLa细胞RNA进行荧光标记，并通过磁珠纯化制备用于微阵列分析的样品。该方法可应用于病毒基因表达时空动态研究。

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怀特黑德研究所研究员基金

第1部分：aRNA标记：染料的氨基烯丙基偶联
<ol>
<li>将1µg的aRNA样品加入到1.5mL的微量离心管中。</li>
<li>在低温或不加热条件下真空干燥样品，直至完全干燥。样品一干燥立即盖上管盖——切勿过度干燥！</li>
<li>向每根管中加入9µl偶联缓冲液，轻轻涡旋震荡1分钟以重悬aRNA。短暂离心使样品沉降至管底，然后将样品置于冰上静置。</li>
<li>向每管Cy3或Cy5染料中加入22µl高纯度DMSO。一管染料足以用于2个样品。Cy3染料用于标记参考样品，Cy5染料用于标记待测样品。</li>
<li>涡旋混匀染料，充分混合。在使用前始终避光保存。染料配制时间不得早于使用前1小时。确保在任何阶段都无水分进入染料/DMSO混合液。</li>
<li>向每个样品中加入11µl已配制好的DMSO/Cy染料溶液，轻轻涡旋充分混匀。</li>
<li>室温孵育30–45分钟。用锡箔纸覆盖样品或将其置于抽屉中，以尽量减少光照暴露。</li>
<li>孵育结束后，向每个样品中加入4.5µl羟胺以终止反应。轻轻涡旋充分混匀。</li>
<li>再次于室温孵育15分钟。用锡箔纸覆盖样品或将其置于抽屉中，以尽量减少光照暴露。</li>
</ol>
第2部分：标记的aRNA纯化
<ol>
<li>使用前轻轻涡旋振荡RNA结合磁珠，以获得均匀的混合物。</li>
<li>在室温下配制aRNA结合混合液。 （表1）</li>
<li>充分涡旋混匀。</li>
<li>将aRNA洗脱缓冲液分装至1.5 mL离心管中，在50–60°C孵育至少10分钟。</li>
<li>向每个样本中加入70µl aRNA结合混合液，通过上下吹打3-4次充分混匀。</li>
<li>将样品从PCR板转移至96孔圆底板中。</li>
<li>向每个样本中加入50 µl的100%异丙醇，通过上下吹打3–4次充分混匀。</li>
<li>在轨道摇床上轻轻振荡平板至少2分钟，以充分混匀样品。</li>
<li>将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。保持培养板在磁力架上直至混合液变澄清，且结合用磁珠完全沉降。</li>
<li>使用真空吸管小心吸去上清液，注意不要扰动磁珠。或者，也可使用移液器小心移除上清液并弃去。此时，由于未结合的染料分子存在，上清液应呈亮粉色或亮蓝色。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>向每个孔中加入100 µl aRNA洗涤液，在摇床上以中等速度振荡1分钟。此步骤中磁珠可能未完全分散。</li>
<li>将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。</li>
<li>使用真空吸管小心吸去上清液，注意不要扰动磁珠。或者，也可用移液器小心移除上清液，并弃去上清液。</li>
<li>从磁力架上取下培养板。</li>
<li>重复洗涤一次nd 用100 µl aRNA洗涤液洗涤。</li>
<li>2分钟后nd 洗涤后，在旋涡振荡器上以最大速度振荡平板1分钟以干燥磁珠。切勿过度干燥样品！</li>
<li>将20µl预热的aRNA洗脱缓冲液加入每个样品中，从磁珠上洗脱aRNA。</li>
<li>在轨道摇床上剧烈振荡平板3分钟，然后检查磁珠是否已充分分散。若未充分分散，则继续振荡。</li>
<li>磁珠完全分散后，将培养板移至磁力架上以捕获磁珠。上清液中含有纯化后的标记aRNA样本，颜色应为浅粉色或浅蓝色。</li>
<li>将洗脱的aRNA小心转移至新的PCR板（或PCR管）中。</li>
<li>（可选步骤）使用NanoDrop分光光度计的微阵列模块，通过测量1.5 µl样品来检测RNA浓度及染料含量。</li>
<li>立即将标记的aRNA杂交至您选择的微阵列平台，或者，您也可以将标记的aRNA在–80°C保存，直至准备进行杂交。</li>
</ol>
表1 aRNA结合反应体系
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>试剂</td>
<td>单次反应所需用量</td>
</tr>
<tr>
<td>RNA 结合磁珠*</td>
<td>10µl</td>
</tr>
<tr>
<td>磁珠重悬液*</td>
<td>4µl</td>
</tr>
<tr>
<td>100% 异丙醇**</td>
<td>6µl</td>
</tr>
<tr>
<td>aRNA 结合缓冲液浓缩液</td>
<td>50µl</td>
</tr>
</tbody>
</table>
*先将RNA结合磁珠与磁珠重悬液混合 **加入异丙醇并充分混匀，然后再加入aRNA结合缓冲液浓缩液。

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

关键步骤
进行氨基烯丙基偶联时，必须在偶联前短时间内（少于1小时）用DMSO重新溶解染料，并确保水分不进入染料/DMSO混合物中，因为水会与染料上的活性基团发生反应。RNA不要过度干燥（可浓缩至1–2 µL，而非完全干燥），并充分重悬于偶联缓冲液中。偶联反应过程中，应将反应物避光保存，偶尔轻轻 flick（轻弹混匀），必要时可短暂离心。
应用/意义
本方案产生的标记RNA可用于与人源、病毒或定制的微阵列杂交，以评估培养细胞在感染后的基因表达应答。微阵列平台各不相同，因此请遵循制造商的说明，由标记探针制备杂交混合液。
利用定制设计的痘病毒芯片1，我们能够根据杂交信号出现的时间以及转录检测是否依赖病毒DNA复制，将基因分类为“早期”或“晚期”等大类。我们观察到每个时间类别中基因的预期功能类别（即预期的早期、中期和晚期基因），但在转录发生的具体时间上存在差异。
<p class="jove_...

<table><tbody><tr><td>CyDye 标记后反应性染料套装</td><td>试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>包含 Cy3 和 Cy5 两种染料</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 紫外-可见分光光度计</td><td>其他</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>或同等性能的分光光度计</td></tr></tbody></table>

痘苗病毒感染及病毒基因表达的时间分析：第3部分

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

该家族Poxviridae由大型双链DNA构成的病毒， exclusively在感染细胞的细胞质中复制。该科成员包括orthopox属包括天花病毒（variola），即人类天花的致病因子，猴痘病毒（monkeypox）以及痘苗病毒（vaccinia，VAC），后者是该病毒科的原型成员。在相对较大的（约200 kb）痘苗病毒基因组中，编码了三类基因：早期基因、中期基因和晚期基因。尽管这三类基因均由病毒编码的RNA聚合酶转录，但它们在病毒生命周期中各自发挥不同的功能。痘病毒在感染过程中采用多种策略来调控宿主细胞环境。为了理解宿主与病毒基因表达的调控机制，我们采用了基因组范围的方法来分析病毒和宿主细胞中的转录本丰度。在此，我们展示了痘苗病毒感染HeLa细胞的时间进程实验，并在感染后的多个时间点采集RNA样本。分别提取并扩增宿主和病毒的总RNA，用于微阵列杂交以分析基因表达。

海拉细胞感染痘苗病毒及宿主与病毒基因表达分析的实验方案。第3部分描述了通过氨基烯丙基偶联染料对宿主和病毒样本的扩增RNA进行荧光标记的过程。共3部分，第3部分。

痘病毒科由含有大型双链DNA的病毒组成，这些病毒仅在感染细胞的细胞质中进行复制。……

您好，我是来自怀特黑德生物医学研究所 Kate Rubins 实验室的 Judy Y。在此我们将演示如何通过染料的氨基烯丙基 LEO 偶联方法，对从感染了痘苗病毒的 HeLa 细胞以及病毒本身所收集的反义 RNA 样品进行标记。随后，我们将展示如何纯化标记后的 RNA，并将其制备用于基因表达微阵列分析中的杂交实验。之前的 JoVE 视频重点介绍了如何进行病毒感染的总 RNA 提取以及 RNA 扩增和扩增步骤。现在让我们开始吧。首先进行 RNA 标记，将一微克的 A RNA 样品加入到 1.5 毫升的微量离心管中。在低温或不加热的条件下真空干燥样品，直至完全干燥。样品一干燥后立即盖紧每个管子。样品干燥后切勿过度干燥。向每管中加入9微升偶联缓冲液，通过轻轻涡旋震荡1分钟重悬A RNA，短暂离心以使样品聚集于管底，然后将样品置于冰上静置。接下来，向每管SCI三或S五染料中加入22微升高质量DMSO，一管染料足以用于两个样品。SCI三染料用于标记参考样品，SCI五染料用于标记待测样品。涡旋染料以充分混匀。请记住，在使用前应始终将染料避光保存。染料应在使用前不超过一小时内配制，且确保在任何步骤中均无水分进入染料的DMSO混合液。向每份样品中加入11 µL已配制的D-M-S-O-S染料混合物，混匀。在室温下轻轻孵育30至45分钟。用锡箔纸覆盖样品或将样品置于抽屉中，以尽量减少光照暴露。孵育后，向每个样品中加入4.5 µL羟胺以终止反应，涡旋混匀。室温下再轻轻孵育15分钟。用锡箔纸覆盖样品或将样品置于抽屉中，以尽量减少光照暴露。为了清洗标签，将RNA结合磁珠涡旋振荡。使用前，于室温下配制A型RNA结合液，并短暂涡旋振荡以获得均匀混合物。充分涡旋振荡使结合液混匀，将A型RNA洗脱缓冲液分装至1.5毫升离心管中，并在50至60摄氏度孵育至少10分钟。向每个样本中加入 70 µL 的 A RNA 结合液，充分混匀，上下吹打三至四次；混匀后，将样本从 PCR 板转移至 96 孔圆底板中。接着，向每个样本中加入 50 µL 100% 异丙醇，通过移液器上下吹打三至四次充分混匀。然后在旋转摇床上轻轻震荡该板，至少持续两分钟。充分混匀样品。将酶标板转移至磁力架上，以捕获磁珠。将平板留在支架上，直至混合物变得透明且结合珠完全沉淀。使用真空抽吸装置小心抽去上清液，注意不要扰动磁珠。或者，也可用移液器小心吸除上清液，并弃去上清液。此时，由于未结合的染料分子，上清液应呈亮粉色或亮蓝色。弃去上清液后，将反应板从磁力架上取下。随后向每个孔中加入100 µL RNA洗涤液，并在摇床中以中等速度振荡反应板1分钟。此步骤中，磁珠可能无法完全分散，需将培养板放回磁力架上，以捕获磁珠。使用真空抽吸装置小心吸取上清液，注意不要扰动磁珠。或者，用移液器小心吸去上清液并弃去。将微孔板从磁力架上取下。用 100 微升 A RNA 洗涤液重复洗涤一次。第二次洗涤后，将微孔板置于轨道摇床上，以最高速度振荡一分钟，使磁珠干燥。注意不要过度干燥样品。通过加入20 µL预热的A RNA洗脱缓冲液，从磁珠中洗脱A RNA。每个样品在旋转摇床上剧烈振荡三分钟。然后检查磁珠是否已完全分散。若未完全分散，则继续振荡。待磁珠完全分散后，将板移至磁力架上以捕获磁珠。上清液中含有纯化后的标记A RNA样本，颜色应为浅粉色或浅蓝色。接下来，小心地将上述A RNA转移至新的PCR板或PCR管中。此时，可通过 NanoDrop 分光光度计测量 1.5 微升样品，以检测 RNA 浓度及样品中染料的含量。使用微阵列模块，立即将标记的 A RNA 杂交至您选择的微阵列平台。或者，您也可将标记的 A RNA 储存于负 80 摄氏度，待准备进行杂交时再使用。这是使用 NanoDrop 分光光度计测量样本浓度和染料掺入情况所得到的代表性分光光度计读数和光密度（OD）图。您可以看到在 260 纳米处的光密度峰，用于计算样本的浓度，以及分别代表 S3 和 SCI5 染料的约 532 和 635 纳米处的两个峰。我们刚刚向您展示了如何对扩增后掺入免疫等位基因的 RNA 样本进行荧光标记，以用于微阵列杂交。进行此操作时，需注意在偶联前不到一小时将染料重悬于DMSO中，并确保水分不进入染料的DMSO混合液，因为水分会与染料上的活性基团发生反应。此外，必要时切勿将RNA过度干燥。样品可离心至1到2微升，无需完全干燥，随后在偶联反应中用偶联缓冲液充分重悬。将反应物置于避光环境中，偶尔轻轻 flicking，必要时可进行离心。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。请务必观看本系列中的其他视频，我们将演示如何进行痘苗病毒的时间过程感染、样本的RNA提取以及RNA样本的线性扩增步骤。

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