Name: 长期使用宽视场显微镜的成像哺乳动物细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 学习使用宽视场显微镜进行哺乳动物细胞长期活细胞成像技术。该方法在37摄氏度恒温条件下观察细胞分裂过程，为神经科学研究提供重要的动态数据。

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作者无任何利益冲突需要披露。

使用宽场显微镜对哺乳动物细胞进行长期成像

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

实际上，我要先将其安装在这里，然后再更换您。现在我要开始吸液，并尽可能轻柔操作。好的，先静置几秒钟。好的。好了。因此，我们生活成像网格的重要特征是：它采用倒置显微镜，这意味着物镜位于样品下方。物镜朝上，整个显微镜——实际上是包括物镜和样品在内的绝大部分组件——都处于37摄氏度环境中。因此，这个塑料箱内的所有部分均维持在37摄氏度。在载物台正上方，我们有空气和二氧化碳的混合气体，其中二氧化碳浓度为5%。其原理是使样品处于类似细胞培养箱的环境中，就像在细胞培养箱中一样。因此，这是我们用于混合空气和CO2的装置，混合后的气体经过加湿和加热，然后通过管道输送到载物台上的样品。今天我们将仅进行单通道荧光检测，即GFP荧光检测。这是输送含5% CO2气体的软管，可直接插入载物台的接口中。这一点很重要。然后我们可以关闭这些窗口，将其移除，接着进入我们的第一个位置。接下来，我将前往第一个视野，即我的对照样本，并根据屏幕上所见来选择具体的位置。因此，每换一个新孔时，我都会确保实际观察显微镜，因为每个孔的焦平面不同，培养皿底部并非完全平整。因此，当从一个孔移动到另一个孔时，需要进行精细调节。目前我位于第一个孔，接下来的操作是：我将进行调焦，刚刚我已打开显微镜的透射光光源。我已经确保所有光线都进入目镜。然后我只需观察一下，确认视野清晰干净。接着，我会关闭透射光，打开荧光光源，检查所观察的细胞是否健康，无凋亡现象。然后，我将其关闭。接下来我要做的是发送信号，现在我将开始选择位置，这意味着我必须将光路切换至相机。这里的这个就是相机。因此，我会让显微镜将所有图像发送到相机，这样在目镜中就看不到任何东西。接下来，在控制显微镜的软件中，我将选择正确的滤光片组，对我们而言是psy滤光片组，然后设定曝光时间。我对这些细胞非常了解，我知道它们需要 0.2 秒的曝光时间。因此，我会将这一参数设置告知软件。接下来，我将进行对焦操作。这个视野中的细胞是活的。灯亮起后，你可以观察到细胞——哦，我不知道你是否能看到细胞，但这个视野之所以理想，是因为所有细胞的状态都非常均一，包括它们的荧光表现；没有凋亡细胞。凋亡细胞通常会非常明亮，而此视野中也没有任何碎片或杂质。你可以看到，这实际上是一个处于中期的细胞，而这是另一个中期细胞，这个细胞可能刚刚完成有丝分裂。我之所以能够判断这一点，是因为看起来这两组染色质彼此之间的排列非常整齐，就像刚刚结束分裂后期一样。这是一个良好的视野。现在我已经确定了曝光时间以及滤光片组设置是正确的，接下来的操作将取决于具体的软件。我将开始采集多个视野位置，此时软件会自动记录该视野的 X、Y、Z 坐标。当我选择下一个视野时，我会再次操作：在选择新的视野时，我会打开快门，观察屏幕上显示的图像，并根据屏幕上的成像结果来选择视野，而不是直接通过目镜观察来判断。所以我没看到我的任何对照样本在这里。但再次强调，即使居中效果很好，这些细胞也会通过我的PS I继续进行，这里就是一个很好的例子。这就是一个我建议避免的情况，看到它有多亮了吗？这太亮了。这可能是凋亡细胞的残留物。我之所以要避免这种情况，是因为它太亮了，当软件自动对焦时，会仅对这个区域对焦，而无法与其他细胞处于同一焦平面。因此，我将无法从该区域获得任何信息。这个看起来不错。这是一个，此处为前期，这是中期。因此，我将在每个孔中选取三个位置进行成像。刚才已经采集了三个位置的图像，现在我将移至下一个孔。因此，您可以看到，我可能会每10分钟采集一次图像，这是一种折中的方案。活细胞成像总是一种权衡，对吧？你既要进行成像，又要保持细胞的健康状态，尤其是当你关注有丝分裂时。因此，你必须尽量减少细胞暴露于荧光光源下的时间。然而，你希望获取信息。因此，你必须进行成像，必须有所权衡，必须决定想要捕捉的内容，以及希望获取哪类信息。就我们的目的而言，有丝分裂通常大约持续一小时。因此，如果我们以10分钟为间隔进行观察，效果已经相当不错了。我们可以看到前期、中期和后期，并且能够观察到在特定处理、药物或siRNA作用下，这些特定细胞周期阶段发生的变化。就我们的目的而言，这已经足够了，但我们始终希望获得更多信息。我们总是希望获得更多的位置信息，或更精细的时间和间隔，或类似的需求。因此，这需要权衡取舍。然后，我将点击开始。因此，我们的软件在第一次扫描时会进行自动对焦。一旦我点击“开始”，它就会启动自动对焦，您将看到快门在自动对焦过程中打开、关闭。现在我将点击开始。这是快门的开启和关闭过程。Z轴电机正在启动，实际上它正在尝试寻找对比度最高的平面，也就是最清晰对焦的平面。您可以在屏幕上看到，系统正在反复寻找最佳对焦平面，这一过程可能看起来令人担忧。其工作原理是驱动Z轴电机，以寻找最佳焦点平面，即图像最清晰的位置。然后在此位置采集图像，并记录该Z轴位置。随后，我们将此Z轴位置用于接下来的12次扫描过程。然后我们将再次执行自动对焦扫描。他们会进行什么样的实验？好的，我们实验室主要关注的是理解什么因素调控有丝分裂进程，或者至少我个人最感兴趣的是弄清楚这一点。利用活细胞成像技术，特别是我们的多点位、长期成像显微镜，您可以对细胞进行连续两到三天的拍摄，观察细胞进入并完成有丝分裂的全过程，并可记录多轮有丝分裂，从而深入理解其动态变化。此外，您还可以向细胞施加药物、RNA 或任何其他类型的干预因素，以研究这些药物或基因在调控有丝分裂进程中的重要作用。由于这并非固定细胞实验，而是活细胞实验，因此可以明确了解在何时需要施加干扰以影响有丝分裂，以及有丝分裂的哪个阶段受到影响。因此，从这一角度来看，该实验具有很强的优势。那么，该实验的主要技术要素是什么？可能遇到哪些问题呢？除了搭建实验装置本身之外，最大的问题就是装置的搭建并不简单。许多人都拥有该装置，但要确保其在您的具体应用中良好运行，仍需仔细调试和验证。经济方面的投入是相当可观的。因此，除了实验装置的搭建之外，还有一个重要的数据处理问题。以拍摄的录像为例，如果你收集了40段录像，每段包含30个细胞，也就是说你刚刚拍摄了40个视野，每个视野包含30个细胞，那么你就必须逐一观看每一段录像，并仔细分析其中每一个细胞。因此，数据分析需要花费非常长的时间。这意味着，你花了两天时间收集的数据，却需要一周的时间来分析。因此，在大量数据采集方面，这是一个非常大的障碍。因此，尽管这是高通量的数据采集，却并非高通量的分析。那么，要如何改进才能使该实验真正实现高通量？我们实验室目前正在开发一个能够自动进行数据分析的程序。这是一个相当不错的程序。它并非完美无缺，人眼的判断始终更胜一筹，但它正逐步接近理想效果。那么，本实验有哪些有趣的应用？能否提及其他领域？除了细胞分裂之外？您是指活细胞成像吗？是的。那么，您可以进行细胞运动性分析。根据所使用的显微镜类型，您可以观察细胞的行为，甚至可以观察肿瘤的发育过程，如果您有这个需求的话。但在那里，只要拥有合适的成像装置，你几乎在任何方面都不会受到限制。我们的显微镜恰好只是宽场显微镜，使用的是 20 倍物镜。因此，这是一种分辨率相对较低的设置，但对我们需要观察的内容而言已经足够了。因此，尽管目前还没有，但显然不存在这样的限制。任何涉及动态实验的研究领域，尤其是生物学，都将真正受益于活体成像技术。例如钙成像，虽然无法在我们的设备上进行，因为那需要活细胞成像。这 definitely 需要活细胞成像。正如我所说，患者检测、运动性检测以及这类实验都会从活细胞成像中显著受益。您是否愿意简要介绍一下您以往的相关经验？您研究这些技术有多久了？之前您从事过什么工作？哇。在我的博士期间，我并没有从事这方面的工作。我做了大量的共聚焦显微镜实验，但没有进行过活体成像。因此，在我博士后期间，我协助King博士搭建了这套装置，用于制备并运行这些样本片段。在博士后阶段，我积累了丰富的经验，既包括在宽场显微镜上进行延时成像，也包括使用共聚焦显微镜进行延时成像。我认为这项技术确实非常强大。你可以获得大量信息，但要使其完美运行并不容易。因此，它确实需要在整个流程的每个细微步骤上都投入大量关注，并极其注重细节。而且，之后你可能仍然会遇到问题。因此，这是一项具有挑战性的应用，但如果这正是你需要用来研究你的科学问题的方法，那么它在这方面就具有不可估量的价值，尽管操作难度较高。因此，务必找到一位熟悉该技术的专家，并加以利用。这就是我的建议。非常好。

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长期使用宽视场显微镜的成像哺乳动物细胞

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