Name: 癌症北欧化工 Stomatogastric神经系统解剖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 37 s
Description: 学习解剖Cancer borealis的口胃神经系统，用于神经生物学和电生理学研究。本方法展示如何分离胃神经节并进行鞘膜去除，以制备适合细胞内和细胞外记录的标本，支持神经环路动态与神经调制研究。

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我们衷心感谢Marder实验室的各位成员。感谢我们的导师Eve Marder博士给予的支持与鼓励。本研究得到了美国国家神经疾病与卒中研究所资助项目NS-17813和NS-058110的资助。

1. 大体解剖
<ol>
	<li>将一只螃蟹置于冰上30分钟，以降低其感觉和运动系统的敏感性。需用冰块从各个方向包围螃蟹。操作螃蟹时应佩戴手套。</li>
	<li>准备进行大体解剖，铺好解剖盘并摆放所需工具。需要的工具有：咬骨钳、骨剪、小剪刀、有齿镊子、带锥形边缘的刮匙、黑色硅胶涂层培养皿以及昆虫针。</li>
	<li>通过抓住螃蟹的后腿将其从冰桶中取出，以防被夹伤，然后将其放入解剖盘中。</li>
	<li>先将螯足逐一向内扭转取下，再以同样的扭转动作取下每条步足。</li>
	<li>使用咬骨钳去除覆盖口器的上颚，并移除柔软的下颚须。</li>
	<li>再次使用咬骨钳，从头胸甲的后外侧端开始，牢固夹住边缘，用力夹断并移除该部分头胸甲。确保移除足够的头胸甲，以便刮匙能够进入开口处。沿头胸甲边缘继续向复眼方向去除，另一侧重复相同操作。</li>
	<li>用刮匙的锥形边缘轻轻刮除头胸甲背侧内面的软组织，操作时始终保持刮匙与头胸甲接触，以避免损伤胃神经系（STNS）。使用咬骨钳将已与组织分离的头胸甲碎片进一步去除。同时分离腹侧头胸甲上的部分软组织，特别注意分离将组织与头胸甲相连的闭壳肌。</li>
	<li>从背侧向后方去除头胸甲，直至心脏位置，此处有两个从小骨片突出的骨化结构。尽可能向前方剪除。在去除最前部的背侧头胸甲时，用一根手指固定头节（“面部”）以保持稳定。</li>
	<li>在头胸甲腹侧，逐个拔除下颌：将咬骨钳固定于一个下颌上，向外扭转以将其从附着的额角片上松脱，然后将其拉出。若操作正确，取出的下颌上应附有两个带肌肉的长条状小骨片。</li>
	<li>使用刮匙分离靠近复眼处头节两侧的组织。用小解剖剪尽可能贴近骨嵴处，逐层剪断组织。</li>
	<li>将螃蟹靠在解剖盘壁上并支撑固定（可用螯足辅助固定）。从额角处剪除唇瓣（“上唇”），确保无残留组织附着。使用骨剪在腹侧头胸甲上做两条对角切口，以取下头节。</li>
	<li>用有齿镊子夹住唇瓣，从腹侧骨片上剪除下唇瓣（“下唇”）。然后轻轻将下唇从剩余的腹侧头胸甲上提起。使用小剪刀将胃的腹侧部分与头胸甲内壁的组织分离。当幽门盲囊可见时，从其两侧切断胃部组织，直至将整个胃从螃蟹体内取出。</li>
	<li>仍用镊子夹住胃的唇部，将胃靠在手掌上，向口中灌注生理盐水。这会使胃膨胀，便于后续切开。从口部开口处开始，沿幽门正中间穿过两盲囊之间的骨片向下剪开。然后斜向剪开两个心部分支。剪除胃内三个齿状结构的尖端。</li>
	<li>将胃组织内面朝下放置在一个较大的黑色硅胶涂层培养皿中。用昆虫针将标本的五个角固定住，并用冷生理盐水充满培养皿，完全浸没整个标本（见图1）。</li>
</ol>
2. 精细解剖
<ol>
	<li>，精细解剖需要使用显微解剖工具。特别需要镊子、弹簧剪以及带钨针的针 holder。还应准备一个透明的、涂有Sylgard的培养皿和一些细金属丝针。</li>
	<li>从最低放大倍数开始，首先固定靠近唇部、原为口 opening 的瓣膜。调整其余大头针的位置，使标本绷紧，并根据需要固定其他必要区域。</li>
	<li>小心抬起覆盖在制备物下部的带有斑点的皮下组织，横向剪去多余部分，留下一块带有两个白点的皮下组织小片。</li>
	<li>剥离制备样本底部附近的黄色、纤细、膜状组织。 mvns 微弱地附着于该组织的下表面。小心分离 mvns 从拉起的黄色组织处分离，沿脑组织旁剪开。</li>
	<li>沿着从脑部向外侧延伸的粗大神经束追踪，这些即为连合神经。当到达连合神经末端时，移除已从脑侧切离的海绵状、略带灰白色的组织团块。</li>
	<li>何处的 离子 和 儿子们 满足CoGs，切除肌肉和组织以暴露其全长 离子 和 儿子们.</li>
	<li>返回斑点状的皮下组织区域并将其剪除。这将在围绕STG的动脉上留下一个开口。通过该开口进行剪切，以分离位于STG两侧的两块肌肉。提起这两块肌肉的末端，并在其下方紧贴处剪开，使其与动脉分离，从而暴露 alns 和 agns. 将覆盖于软骨上方的侧翼肌肉向上分离至软骨处 stn.</li>
	<li>切除围绕STG的动脉组织，直至 mvns, dgn, 和 dvn 向下切至腰椎神经，切开覆盖其上的浅白色细薄组织 lvns.</li>
	<li>定位 psn 听小骨近制备底部处。可利用psn进行定位 lvn 和 dlvn 连接处</li>
	<li>接下来按照 dlvn 向下以定位 pyn 和 pdnpyn 常延伸至幽门壶腹并包裹至开口处。 pdn 分出的分支 dlvn 位于幽门壶腹与心-幽门瓣肌肉之间。在其中一条神经上保留部分肌肉组织，因为在将标本转移至透明的Sylgard培养皿时，这些神经容易混淆。</li>
	<li>当所有神经均暴露后，切断STNS与胃部组织及无关神经之间的任何残留连接。小心地将STNS从胃的其余部分分离，剪断任何遗漏的连接。</li>
	<li>用剩余的胃组织在Sylgard培养皿表面轻轻擦拭，对透明的Sylgard培养皿进行预处理，直至其表面不再过于黏腻或干燥。Sylgard具有疏水性，若未经过此步骤处理，STNS会强烈黏附于Sylgard包被的培养皿表面。</li>
	<li>向培养皿中加入一些冷生理盐水。用镊子夹住连合神经的上端，将STNS移至干净的Sylgard培养皿中。</li>
	<li>将STNS固定在Sylgard上。切断脑部与神经连合之间的连接，并使用微细图钉先将CoGs的四个末端固定住。通过检查确认制备物正面朝上， ivn 指向远离Sylgard的方向。 dgn 当颞上回（STG）正面朝上时，应使其末端略低于STG下方。用细金属针将其余神经末端固定。</li>
	<li>清除STNS上残留的任何肌肉或组织。</li>
	<li>使用持针器和略微弯曲的细钨针剥离STG。在STG鞘膜远离细胞体的一角刺一个小孔，并利用该孔插入至鞘膜各层之间。小心切开已分离的鞘膜瓣，以暴露STG神经网和细胞体。</li>
	<li>将神经鞘的任何瓣状部分用图钉固定，以增加对细胞体的可及性，并为细胞内记录稳定固有咽侧神经节（STG）。重新固定其余的STNS，确保每条神经拉紧且间距适宜，以便进行细胞外记录（见图3）。</li>
</ol>
3. 结果
<ol>
	<li>理想情况下，所有神经均应无切口和损伤，尤其是需要进行记录的神经。神经不得缠绕或扭曲。胃中神经节（STG）应保持完整，所有细胞围绕神经髓呈胡须状排列。完整的STNS具有双侧对称结构，外形类似小人图，其中lvns作为其 腿， mvns 将肢体和前端视为头部。</li>
</ol>
缩写：
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>STNS</td>
			<td>口胃神经系统</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STG</td>
			<td>口胃神经节</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoG</td>
			<td>连合神经节</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG</td>
			<td>食管神经节</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mvn</td>
			<td>中腹侧神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ion</td>
			<td>下食管神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>son</td>
			<td>上食管神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agn</td>
			<td>前胃神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aln</td>
			<td>前外侧神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dgn</td>
			<td>背胃神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dvn</td>
			<td>背腹侧神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lvn</td>
			<td>外侧腹侧神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psn</td>
			<td>后胃神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyn</td>
			<td>幽门神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pdn</td>
			<td>幽门扩张神经</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dlvn</td>
			<td>外侧腹侧神经的背支</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ivn</td>
			<td>下腹侧神经</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<img alt="甲壳动物神经系统的解剖示意图，显示神经通路和连接。" src="/files/ftp_upload/1207/1207fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1">
图1：示意图显示在解剖前胃中 STNS 的大致位置。
<img alt="甲壳动物胃部和幽门肌示意图；肌肉群以解剖学缩写标注。" src="/files/ftp_upload/1207/1207fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2">
图2：胃下部各肌肉的示意图，以及浅绿色叠加显示的STNS。图中列出了STG中每种细胞类型所支配的肌肉。在计划解剖携带特定细胞信号的神经时，该图谱非常有帮助（由Nadim实验室提供）。
<img alt="神经元记录示意图；STG装置中的细胞内胞体和细胞外神经记录。" src="/files/ftp_upload/old/1207_2009_1_12_5/figure_3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3: STNS 的示意图，显示细胞内电极和细胞外记录井（引自 Marder 和 Bucher，2007）。

<ol><li>Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris-Warrick%2C+RM+%22Dynamic+Biological+Networks%3A+The+stomatogastric+nervous+system%22">Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system</a>. , MIT Press. Boston. (1992).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus%2C+Homarus+Americanus+and+Panulirus+argus+%28Decapoda+crustacean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).</li>
<li>Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stomatogastric+Nervous+System%3A+Structure+and+function+of+a+small+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network.</a> Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).</li>
</ol>

STNS 解剖是进行电生理学或免疫组织化学实验，或获取细胞用于细胞培养的第一步。无论计划进行何种实验，大体解剖步骤均保持不变。然而，精细解剖可能有所不同。重要的是需提前规划好需要从中记录信号的细胞和神经。STG 中大多数神经元具有支配胃部至少一块肌肉的突起（见图2），并根据其支配的靶器官进行分类。因此，需要进行细胞外记录，以完全确认正在进行细胞内记录的细胞身份。幽门节律的频率和稳定性用于监测标本的健康状况。因此，许多实验包括对 lvn 的细胞外记录。dgn 常用于监测胃节律。stn 通常对大多数实验至关重要，因为 STNS 前端含有大量调制性细胞，切断该神经可能导致幽门节律和胃节律停止或变得不规则。
尽管精细解剖步骤的顺序并不重要，但我们发现，在将STG与周围组织分离之后，再松开外周神经末端与肌肉的连接，能够更轻松地完整取出STNS。这种方法可使STG和stn保持足够的张力，从而安全、便捷地去除其周围的肌肉和组织。
当制备好的标本置于透明的Sylgard培...

<table><tbody><tr><td>黑色Sylgard 170</td><td>其他</td><td>Dow Corning</td><td>170</td><td>大体解剖</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>6号昆虫针</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-65</td><td></td></tr><tr><td>梅奥剪刀</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-17</td><td></td></tr><tr><td>微型刮匙</td><td>手术</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>15 V 4313</td><td></td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>组织镊</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>精细钨丝（直径0.001英寸）</td><td>手术</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>精细解剖</td></tr><tr><td>5号精细镊</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>微型固定针</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria弹簧剪（7mm刀片）</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100×15 mm）</td><td>其他</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>超精细镊#5SF</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>其他</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>钨针</td><td>手术</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>显微镜</td><td>Wild</td><td>MC3</td><td>其他</td></tr><tr><td>乔纳蟹（&lt;em&gt;C. borealis&lt;/em&gt;）</td><td>动物</td><td>Commercial Lobster</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cancer borealis 胃神经系统的解剖

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

口胃神经节（STG）是研究细胞与网络相互作用的优良模型，因为它所含的细胞数量相对较少（在C. borealis中约有25个），且这些细胞已被充分表征。STG中的细胞表现出多种输出模式，负责调控胃部的运动功能。胃部分为胃磨和幽门：胃磨通过三个内部齿状结构将食物破碎，而幽门则在食物进入中肠前对其进行过滤。STG产生两种节律性输出，分别控制胃磨和幽门，这类输出被称为中枢模式发生器（CPGs）。STG中的每个细胞均可参与其中一种或两种节律活动。这些中枢模式发生器为研究神经调制、稳态、细胞与网络的变异性、网络发育以及网络恢复提供了理想系统。
从乔纳蟹（Cancer borealis）中分离口胃神经系统（STNS）的过程分为两个步骤：粗略解剖和精细解剖。在粗略解剖过程中，将整个胃从蟹体内完整取出；在精细解剖过程中，使用解剖显微镜和显微解剖工具从胃组织中分离出STNS（见图1）。STNS包括口胃神经节（STG）、食道神经节（OG）、连合神经节（CoG），以及支配胃部肌肉的神经。本文介绍了为进行电生理实验而完整解剖STNS的方法，其中将对STG中的细胞进行细胞内记录，并利用外周神经进行细胞外记录。文中还展示了准确定位目标神经的正确技术，以及我们去除神经节鞘膜以暴露细胞体和神经纤维网的技术。

通过使用 Jonah 螃蟹（C. borealis）的口胃神经系统（STNS），可开展电生理学、免疫组织化学以及细胞培养研究。STNS 的提取分为两个步骤：粗解剖和精细解剖。

Cancer Borealis 胃神经系统的解剖

口胃神经节（STG）是研究细胞与网络相互作用的优良模型，因为它所含的细胞数量相对较少……

该操作首先对螃蟹的胃进行大体解剖，移除螃蟹的附肢和背侧腕节。将整个胃从动物体内分离出来。切开胃部，并将其平铺固定在黑色解剖盘上。在进行精细解剖之前，需将斑马鱼的胃神经系统从胃部解剖出来，并转移至一个洁净的经Sard涂层处理的培养皿中，以去除鞘膜，为电生理实验做准备。大家好，我是来自布兰迪斯大学Martyr实验室的Rachel Au。我是Gabrielle Gutierrez，同样来自Martyr实验室。今天我们将向您展示一种从三叶蟹（Cancer borealis）中分离体壁胃神经系统的方法。在我们的实验室中，利用这种螃蟹的神经系统开展电生理学、免疫组织化学以及细胞培养实验。通过这一神经网络，我们可以研究神经生物学中的多个基本原理，例如神经调制稳态、网络变异性、网络发育以及网络恢复等。那么我们开始吧。在开始解剖之前，必须将螃蟹用冰完全覆盖30分钟以使其麻醉。请确保从各个方向都用冰包围螃蟹。冰会使螃蟹的感觉和运动系统失活，但在取出螃蟹时，螃蟹可能仍有反应，同时需让螃蟹保持低温。在开始之前，准备好进行粗略解剖所需的设备，包括解剖托盘、罗恩颌骨剪、小剪刀、齿状镊子、带锥形边缘的刮勺、表面涂有黑色硅胶的培养皿以及昆虫针。戴上手套做好准备。30分钟过后，抓住螃蟹的后腿将其从冰桶中取出。为避免被夹伤，先将其放入解剖盘中，然后通过向内扭转的方式取下双螯。接下来，使用相同的扭转动作逐一移除每条附肢。在动物的附肢全部去除后，使用尖头镊子移除覆盖口器的上颚以及柔软的第二上颚。再次使用尖头镊子，从螯足的后外侧末端开始，牢固地夹住其边缘，夹紧镊子并将该部分螯足折断取下。确保去除足够的腕部组织，以便刮刀能够进入开口处。继续去除腕部边缘直至眼部，并在另一侧重复此操作。使用刮刀的锥形端，轻轻将柔软的内部组织从背侧腕部的顶部刮除。操作时，保持刮铲与头甲接触。为避免损伤STNS，使用Ron Jos工具将已与组织分离的头甲部分敲除。从背侧头甲开始敲除，直至露出头甲上两个微小的S形突起为止。尽可能向前方切割。用一根手指固定头胸部，同时去除背侧头甲最前端的部分。将部分软组织从腹侧头甲上分离。务必分离掉附着在头胸甲腹面并将组织与头胸甲相连的任何内收肌。通过将错误的颚部固定住，将颚向外扭转，逐个拔出上颚；拔出时应带出两条带有肌肉的长条状障碍物，这些肌肉应附着在被取出的上颚上。操作正确时，应将靠近复眼两侧头盖部分的组织分离干净。使用解剖刀和小型解剖剪，紧贴听小骨的脊部，逐层切割组织。将蟹的剩余部分支撑在解剖盘上。利用已分离的螯足，将所有上唇从口器前部剥离。使用小型剪刀或骨剪，在腹侧腕关节处做两个斜切口。为去除头胸部，现在用有齿镊夹住上唇，并从腹面将下唇从口器处剪下。轻轻将唇部从剩余的腹侧头胸部抬起分离。使用小剪刀将胃的腹侧部分与连接贲门的组织分离。当幽门盲囊可见时，从其两侧切断胃与周围组织的连接，直至将

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