Name: 现场共聚焦显微镜对斑马鱼的胚胎脑成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 学习使用共聚焦显微镜对斑马鱼胚胎进行单细胞分辨率的活体脑成像技术。该方法通过注射mRNA和特制塑料载玻片固定，实现发育中脊椎动物大脑的高分辨率可视化，为发育神经科学研究提供重要工具。

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非常感谢Jennifer Gutzman博士，该技术最初由她在Sive实验室开发。同时感谢位于马萨诸塞州波士顿的达纳-法伯癌症研究所J. B. Green博士，他慷慨提供了编码CAAX-GFP mRNA的质粒。共聚焦成像在怀特黑德研究所的W. M. Keck基金会生物成像中心完成。HS的研究由美国国立卫生研究院（NIH MH70926）资助。EG获得了美国国家科学基金会（NSF）博士前奖学金的支持。

1. 准备注射用mRNA
<ol>
	<li>本实验所用的 mRNA 是由编码 CAAX-eGFP（memGFP）mRNA 的质粒转录而来。首先，按照 Gutzman 等人（2008 年）的方法对质粒进行线性化处理。</li>
	<li>然后使用 mMessage mMachine 试剂盒转录 memGFP mRNA。</li>
	<li>将获得的 mRNA 稀释至 1 μg/μl，分装后于 -80°C 保存。</li>
	<li>制备含 1% 琼脂糖的注射模具，模具中的凹槽宽度应与单细胞期胚胎的宽度一致。</li>
	<li>注射前一天，设置交配笼，将雄鱼与雌鱼隔开。</li>
	<li>注射当天，使用微量移液器拉针仪制备毛细玻璃注射针，以备注射使用。</li>
</ol>
2. 注射 mRNA
<ol>
	<li>注射当天，将一份浓度为 1μg/μl 的 memGFP mRNA 冰上解冻。</li>
	<li>用无菌水将 mRNA 按 1:5 比例稀释，终浓度为 200ng/μl，并置于冰上保存。</li>
	<li>用制备好的浓度为 200ng/μl 的 memGFP mRNA 向毛细玻璃针中加载 1μl。</li>
	<li>将装有 mRNA 的针头插入连接至气体驱动显微注射仪的显微操作器中。</li>
	<li>调节注射体积至 1nl。</li>
	<li>取出前一天已配对好的野生型斑马鱼交配盒中的隔离挡板。</li>
	<li>在胚胎产出后立即收集，并将其置于含胚胎培养液（Westerfield, 1995）的琼脂糖注射模具中，使单细胞朝向远离显微操作器的一侧。</li>
	<li>穿过卵膜和卵黄进行注射，使 mRNA 直接注入单细胞内。每次实验注射约 50 个胚胎。若细胞已发生分裂，则不应注射。</li>
	<li>将胚胎置于 28°C 的胚胎培养液中过夜孵育。</li>
</ol>
3. 胚胎的固定与成像
<ol>
	<li>为了固定和成像胚胎，在预定观察时间点前一小时，于体视显微镜下用镊子去除胚胎的绒毛膜。</li>
	<li>准备用于固定最多4个胚胎的载玻片。
	<ul>
		<li>使用硅酮真空油脂将盖玻片密封在特制的2 mm厚塑料载玻片的底面，该载玻片中央有一个直径约1 cm的孔。</li>
		<li>用0.7%琼脂糖填充载玻片上的孔，静置约20分钟，直至凝固。</li>
		<li>琼脂糖凝固后，使用200 μl移液器吸头取出小块琼脂糖，形成用于固定每个胚胎的圆柱形孔洞。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>在解剖显微镜下，将胚胎放置于填充了琼脂糖的载玻片上。加入50 μl三卡因（tricaine）以麻醉胚胎（Westerfield, 1995）。</li>
	<li>用镊子将胚胎调整至琼脂糖中的圆柱形孔内，使脑部或目标区域紧贴下方的盖玻片。</li>
	<li>在琼脂糖中的胚胎上方覆盖另一张盖玻片，并用硅酮真空油脂密封固定。</li>
	<li>使用倒置式荧光激光扫描共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜对胚胎进行成像。采用63倍或更高倍数物镜，以获取神经上皮内单个细胞的高分辨率图像。</li>
	<li>图像通过LSM软件导出为TIFF文件，并使用Photoshop进行分析。</li>
</ol>
4. 代表性结果/成果
图1显示了24小时斑马鱼中脑与后脑脑室之间神经上皮的代表性共聚焦图像。每个细胞均用膜结合型绿色荧光蛋白（GFP）标记。
<img alt="荧光显微镜，细胞结构，63倍放大，蛋白质定位，生物学分析" height="449" src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" width="450" data-altupdatedat="1773047343000"> 
图1. 注射memGFP的24小时受精龄斑马鱼胚胎的活体共聚焦成像。 
(A) 24小时受精龄胚胎的神经上皮，每个细胞由GFP标记出轮廓。成像区域分隔中脑和后脑脑室（分别标记为M和H），形成中脑-后脑边界。

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

在本视频中，我们演示了一种将 mRNA 注射到单细胞斑马鱼胚胎中的方法。此处，我们使用编码膜定位 GFP 的 mRNA 来标记每个细胞。随后，我们展示了如何固定并以单细胞分辨率对发育中的脑部进行成像。该技术使我们能够研究一种新型的细胞形态变化——基底收缩，这种变化是中脑-后脑边界形成所必需的（Gutzman 等，2008）。对其他类似现象进行类似的分析，有望显著拓展我们对脊椎动物形态发生及其潜在细胞生物学机制的理解。

<table><tbody><tr><td>SeaKem GTG 琼脂糖</td><td> 试剂</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>工具</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>硼硅酸盐 1.0 mm 外径 × 0.5 mm 内径/纤维 100 mm</td></tr><tr><td>硅脂真空润滑剂</td><td>试剂</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont #5 Bio Inox</td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;l 移液器吸头</td><td>工具</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>适用于 24 hpf 胚胎的合适规格。</td></tr><tr><td>mMessage mMachine 体外转录试剂盒</td><td>试剂</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>SP6 RNA 聚合酶</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 激光共聚焦显微镜</td><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>工具</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>工具</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>工具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

活体斑马鱼胚胎大脑的共聚焦显微镜成像

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

在本视频中，我们展示了本实验室开发的一种方法，用于分析斑马鱼胚胎脑部弯曲和折叠过程中所需的细胞形态变化与重排（Gutzman 等，2008）。该分析为理解脊椎动物脑三维结构发育所依赖的细胞生物学基础提供了新的视角，并显著提升了我们研究神经管形态发生的能力。斑马鱼胚胎脑的成形始于受精后18小时（hpf），此时神经上皮内的脑室开始扩张。到24 hpf时，神经管形态发生的初始阶段已基本完成。采用本方法，可在受精后单细胞阶段向胚胎注射编码膜定位绿色荧光蛋白（memGFP）的mRNA。注射并孵育后，将处于18至24 hpf阶段的胚胎倒置固定于琼脂糖中，利用共聚焦显微镜进行成像。值得注意的是，斑马鱼胚胎具有高度透明性，是荧光成像的理想模型系统。尽管我们的分析主要集中于中脑-后脑边界及后脑区域，但该方法亦可扩展应用于斑马鱼其他区域的观察，成像深度可达80–100 &mu;m。

在本视频中，我们演示了一种利用共聚焦显微镜在单细胞分辨率下对活体斑马鱼胚胎中发育中的脊椎动物大脑进行分析的方法。该方法包括对单细胞斑马鱼胚胎进行显微注射，随后对发育中的大脑进行固定和成像的技术流程。

在本视频中，我们展示了本实验室开发的一种方法，用于分析细胞形态变化及重排在组织弯曲和折叠过程中所起的作用。

该操作从注射单细胞期斑马鱼胚胎开始，将胚胎置于注射模具中，使其细胞朝向远离注射装置的方向。随后，通过注射针穿过卵黄进入细胞，向胚胎中注射 mRNA。第二天。将塑料载片孔中填充琼脂糖凝胶。随后将麻醉后的胚胎倒置放入琼脂糖凝胶的孔洞中，并通过共聚焦显微镜进行成像。大家好，我是来自麻省理工学院生物系及怀特黑德生物医学研究所 Hazel Sieve 博士实验室的 Grabham。今天，我们将向您展示一种在单细胞阶段对斑马鱼胚胎进行显微注射，并随后通过共聚焦显微镜对大脑进行活体成像的操作流程。在我们的实验室中，该方法被用于在单细胞分辨率下研究脊椎动物大脑的形态发生过程。现在，让我们开始吧。本实验所用的 mRNA 是由编码 C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A 膜结合型 GFP 的质粒转录而来。首先，用 NotI 酶切消化将质粒线性化，然后使用 M message and machine 试剂盒以线性化的质粒为模板转录膜结合型 GFP mRNA。mRNA 转录完成后，定量并将所得 mRNA 用无核酸酶水稀释至 1 微克/微升，分装后于 -80°C 保存备用。在注射前一天设置交配笼，并在注射当天将雄鼠与雌鼠分笼饲养。使用显微注射仪和拉针仪制备用于注射的毛细玻璃针。在注射当天，制备含有1%琼脂糖凝胶模具，其加样槽宽度与单细胞期胚胎相当；将浓度为1微克/微升的膜定位GFP mRNA在冰上解冻。用无菌水将mRNA按1:5比例稀释，使其终浓度为200纳克/微升，并保持在冰上。用制备好的浓度为200纳克/微升的膜定位GFP mRNA向毛细玻璃注射针中加载1微升。在此，我们向 mRNA 中加入 0.05% 酚红，以便在注射时可见。将装有样品的针头置于连接到气动显微注射仪的显微操作器上。调节注射体积至 1 纳升。接下来，拉开前一天已在交配笼中设置好的野生型鱼的隔板。一旦鱼产卵，立即收集胚胎。用胚胎培养基填充AGA玫瑰形注射模具，并用单细胞朝向远离显微操作仪的一侧，将胚胎在模具中摆放整齐。通过绒毛膜和卵黄将mRNA直接注入单细胞中。每次实验大约注射50个胚胎。如果细胞已经分裂，则不应再进行注射。注射完成后，将胚胎置于胚胎培养基中，在28摄氏度下过夜孵育。经过过夜培养后，注射后的胚胎即可进行制片和成像。开始此操作前，先在体视显微镜下用镊子去除胚胎的卵膜，操作时间应在目标时间点前一小时；准备一张载玻片用于固定最多四个胚胎。然后在载玻片上加入0.7%琼脂糖，加至载玻片顶部，静置约20分钟，直至琼脂糖完全凝固。待琼脂糖凝固后，使用200微升移液器吸头在琼脂糖上打一个小孔，形成用于固定每个胚胎的圆柱形孔洞。固定前用镊子移除琼脂糖塞。将胚胎置于盛有琼脂糖的载玻片上，在解剖显微镜下进行操作。加入 50 µL 三卡以麻醉胚胎。使用镊子将胚胎倒置放入 aros 的圆柱形孔中，使脑部或感兴趣区域紧贴下

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生物学

现场共聚焦显微镜对斑马鱼的胚胎脑成像

本方案描述了在活体斑马鱼胚胎中对单个神经元或神经嵴细胞进行成像的方法。该方法利用荧光共聚焦延时显微镜观察细胞行为及肌动蛋白的定位。...

斑马鱼胚胎中单个神经元和神经嵴细胞的活体成像及肌动蛋白细胞骨架观察

理解塑造早期胚胎的形态发生过程的关键在于能够以高分辨率对细胞进行成像。本文介绍一种在完整斑马鱼胚胎中利用膜定位的绿色荧光蛋白对单个细胞或少量细胞簇进行标记的技术。...

斑马鱼后脑中细胞的标记与成像

本视频展示了一种方法，该方法结合了电穿孔技术和共聚焦显微镜技术，用于对发育中的斑马鱼前脑中的单个神经前体细胞进行活体成像。体内水平上对前脑神经前体细胞在克隆水平的发育过程分析可通过此方法实现。...

延时活体成像观察发育中斑马鱼前脑内克隆相关神经前体细胞

介绍了对幼年斑马鱼脑血管发育进行成像的方法。同时提供了促进三维成像以及利用化学处理手段调控脑血管发育的技术。...

斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

本文介绍了一种通用的固定方法，可在不干扰斑马鱼胚胎正常发育的情况下，实现对活体斑马鱼胚胎后部体轴发育过程的长期延时成像。...

一种用于斑马鱼发育长期成像的通用固定方法

活体成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜实时观察斑马鱼发育过程中大量多色Brainbow标记细胞的技术。...

利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

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体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

我们展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜对发育中斑马鱼视顶盖内的小胶质细胞进行活体成像的方法，从而实现对这些细胞动态行为的分析 体内.

活体成像与斑马鱼胚胎小胶质细胞动态的表征

本文介绍了一种详细的实验方案，利用共聚焦显微镜检测表达GCaMP钙指示剂的转基因斑马鱼脑区中神经活动的方法。...

体内 共聚焦荧光成像技术用于观察部分固定幼年斑马鱼在感觉刺激下诱导的神经活动

学习使用共聚焦显微镜对斑马鱼胚胎进行单细胞分辨率的活体脑成像技术。该方法通过注射mRNA和特制塑料载玻片固定，实现发育中脊椎动物大脑的高分辨率可视化，为发育神经科学研究提供重要工具。

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