斑马鱼脑室注射液
2009年4月6日
神经管形成后，神经上皮收缩和皱褶而胚胎脑脊液（eCSF）形成的胚胎脑室管填充。我们开发这个脑室注射技术，以更好地可视化的充满液体的空间，相反，在一个活的胚胎神经上皮形状。
该程序从斑马鱼胚胎的分期开始。当胚胎达到感兴趣的阶段时，将它们从冠状体中取出。接下来，用用于安装胚胎的移液器尖端在 aros 涂层培养皿中打孔，然后将胚胎轻轻地放入孔中，尾巴向下。
胚胎安装后，通过后脑小心地将荧光芯片注入胚胎的脑室腔。脑室注射后，对胚胎进行成像，并使用 Photoshop 处理数据。大家好，我是来自马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院怀特黑德生物医学研究所 Hazel Sieve 博士实验室的 Jennifer Gutman。
今天我们将向您展示斑马鱼脑室注射的程序。我们在实验室中使用该程序来研究活斑马鱼的脑室形成和神经上皮形态发生。由于透明斑马鱼胚胎的性质，表征脑室形状可能很困难。
该技术是一种有用且简单的方法，可以区分充满液体的空间与周围组织，并表征可能具有脑室形成缺陷的突变胚胎。那么让我们开始吧。为了准备注射斑马鱼脑室，我们首先制作注射针。
Sutter 仪器的针极用于拉动毛细管针。然后用荧光染料填充毛细管针，例如德克萨斯红糊精。接下来，将填充的针头安装在显微注射装置的微型纵器中。
将针头以一定角度剪成合适的大小。要创建斜面尖端，请测量针头的液滴尺寸，并检查每次油中注射的液滴是否在 1 到 2 纳升之间。要开始此程序阶段，根据 Kimmel 的说法，所有胚胎的胚胎都应比感兴趣的阶段提前 30 分钟注射。
例如，要在受精后 24 小时研究心室，请在受精后 23 个半小时注射胚胎。将感兴趣阶段的胚胎置于立体显微镜下，并使用镊子小心地从胚胎中取出冠状物。接下来，使用涂有 1%aros 戳孔的塑料培养皿制成胚胎的 aros 培养皿，并使用 1 至 200 微升的塑料移液管尖端在 aros 上戳孔。
使用镊子小心地从孔中取出 aros 塞子。将胚胎和胚胎培养基转移到带孔的 aros 培养皿中。将 trica 添加到培养基中以麻醉胚胎并防止运动。
在实验过程中，轻轻地将胚胎尾巴向下放入孔中并调整其方向，使注射装置位于胚胎的后侧。现在胚胎在玫瑰培养皿中被正确放置和定位，我们准备好进行脑室注射了。首先，安排显微作设置，使针尖与高功率胚胎处于同一视野中。
小心地将针头穿过后脑的薄屋顶板，就在 R 零 R 一个铰链点的后面，不要碰到下面的脑组织，注入足够的染料以完全充满脑室。可能需要多次注射才能充满心室空间，具体取决于胚胎的阶段。当胚胎被注射并准备好成像时，为胚胎准备一个新的 aros 培养皿。
使用干净的 1%aros 涂层培养皿，在培养皿上戳孔并取下塞子。将胚胎转移到培养皿中并添加 trica 以麻醉胚胎并防止运动。将心室注射胚胎的尾部放入孔中，以获得背影。
胚胎现在可以进行成像。使用透射光拍摄图像。不要移动胚胎或显微镜非常关键。
接下来，更改显微镜上的设置并使用荧光灯拍摄图像。重新定位胚胎以使用透射光和荧光进行横向成像。将所有图像保存为文件以进行 Photoshop 的图像处理。
要在 Photoshop 中处理图像，请打开在同一位置拍摄的同一胚胎的透射光和荧光图像。确保所有设置都相同 对于每个图像，将荧光图像拖动到透射光图像上，并将它们与所选荧光图像完全对齐。选择图像调整，然后替换颜色并将黑色背景更改为白色。
在替换颜色窗口中，向右调整模糊系数，直到荧光图像看起来颜色均匀。在 layers 窗口中，选择 multiply。要查看叠加图像，您的心室间隙图像应与透射光图像相匹配。完全。
保存此文件，然后对任何其他图像重复此作。如果心室注射正确进行，图像应在非弥漫性染料中具有锋利的边缘，如这些 25 小时的图像所示。受精后，类型胚胎面板 A 显示明场图像，面板 B 显示荧光图像，面板 C 显示叠加图像。
另一方面，如果在心室注射过程中针头插入得太深，它会进入心室间隙下方的脑组织并导致注射错误。这导致染料在脑室间隙外和卵黄中可见，如图所示。图 E 显示了明场图像。
图 F 显示荧光图像，图 G 显示叠加图像。叠加图像的侧视图显示在面板 H 中，箭头表示染料已超出脑室空间的区域。在本视频中，我们演示了如何将荧光染料注射到发育中的斑马鱼脑室中。
这种方法用于可视化脑室空间与周围神经上皮的对比，对于确定脑室空间的形状以及周围脑组织的形状非常有用。这项技术使我们能够更好地了解活胚胎中脑室形成和脑形态发生随时间的变化过程。它是研究脑室形成缺陷和初步表征脑形态发生突变体的绝佳工具。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文描述了一种在斑马鱼胚胎中进行脑室注射的技术，用于可视化胚胎脑脊液腔。该方法增强了对活体胚胎中神经上皮形态和流体动力学的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 胚胎学
背景
- 神经管形成是胚胎发育中的一个关键过程。
- 胚胎脑脊液（eCSF）在脑脊液腔的形成中起作用。
- 在活体胚胎中可视化这些结构可以提供对发育过程的洞察。
- 脑室注射技术允许更好地成像这些结构。
研究目的
- 开发一种方法将荧光染料注射到斑马鱼胚胎的脑室中。
- 改善胚胎大脑中充满液体的空间的可视化。
- 增强对发育过程中神经上皮动力学的理解。
使用的方法
- 将斑马鱼胚胎分期到所需的发育阶段。
- 使用移液管尖将胚胎固定在涂有aros的皿中。
- 通过后脑注射荧光染料到脑室空间。
- 注射后对胚胎进行成像并用Photoshop处理数据。
主要结果
- 脑室注射技术成功可视化了eCSF充满的空间。
- 注射后的胚胎显示了神经上皮形状的清晰成像。
- 该方法为研究胚胎大脑发育提供了可靠的方法。
- 数据处理技术增强了成像结果的清晰度。
结论
- 脑室注射技术对于斑马鱼胚胎的活体成像是有效的。
- 该方法可用于研究神经发育的各个方面。
- 未来的应用可能包括研究基因改造对大脑发育的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing fluid-filled cavities in live embryos supports mechanistic de-risking in neurodevelopmental target validation by clarifying structure-function relationships. This technique enables quantitative assessment of neuroepithelial dynamics, improving predictive confidence in early discovery. It aids in prioritizing genetic or pharmacological interventions based on phenotypic brain morphogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular morphology as a phenotypic readout for neuroepithelial shape changes.
- Operational Value: Provides a live-imaging compatible method to distinguish fluid spaces from tissue in transparent models.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking genetic perturbations to ventricular defects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fluorescent and brightfield outputs for comparative analysis across conditions.
- Quantitative Output: Facilitates measurement of ventricle size and shape as dependent variables in screening campaigns.
- Reproducibility: Enables consistent ventricular labeling for cross-experiment comparison in multiwell formats.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved vertebrate brain ventricle formation, relevant to human neurodevelopmental disorder studies.
- Translational Continuity: Connects early neuroepithelial patterning to later brain structure and function.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in distinguishing primary ventricular defects from secondary tissue abnormalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening requires structural validation of fluid-filled compartments in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct visualization of ventricle formation dynamics.
- Screening: Delivers assay-ready samples with quantifiable ventricular morphology for compound or genetic library evaluation.
- Analytics: Provides image-based morphometric outputs that can be statistically compared across experimental groups.
- Translational Research: Links embryonic ventricle phenotypes to potential postnatal neurological outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for neurodevelopmental target and pathway validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing phenotypic ambiguity in neurodevelopmental models.
- Operational Value: Standardizes ventricular labeling for reproducible imaging across laboratories and timepoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural phenotyping data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates based on brain morphogenesis safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and microinjection techniques.
- Dependent on fluorescent dye compatibility and injection volume precision (1-2 nL).
- Necessitates standardized mounting and anesthesia protocols to prevent embryo movement during imaging.
- Requires image processing capability (e.g., Photoshop) for overlay and analysis of brightfield and fluorescent channels.
- Limited to embryonic and early larval stages due to increasing tissue opacity and ventricular accessibility.
