酿酒酵母中利用定量蛋白质组学鉴定蛋白质复合物

该实验步骤首先在SLAC对照菌株的培养基中培养诱饵菌株，培养基中含有普通氨基酸，以及重同位素标记的赖氨酸和精氨酸。将两种菌株等量混合后，通过液氮研磨裂解。粗裂解液先经离心沉淀，再通过与spheros珠结合进行澄清。随后，细胞裂解液与IgG珠结合。

通过蛋白酶消化、切割并沉淀与IgG珠粒结合的蛋白质。样品现可进行质谱分析。大家好，我是来自不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所细胞环境生物学系Lone实验室的Jesse Chao。

今天向您展示一种称为SILAC的定量蛋白质组学分析方法，该方法结合了亲和纯化技术。我们在实验室中使用此方法研究蛋白质复合物。

现在开始实验。在此步骤中，诱饵菌株含有普通氨基酸，而SLAC对照菌株含有重同位素标记的赖氨酸和精氨酸。首先，分别培养一升诱饵菌株和对照菌株，直至达到屏幕上所示的数值。接着，将培养物倒入500毫升的Nalgene离心管中。

将细胞在2,580 ×g条件下离心以平衡负载，弃去上清液，用50毫升冷的去离子水重悬沉淀。在将细胞转移至50毫升离心管的过程中，于3,000 ×g离心收集细胞。此时，可将细胞沉淀于-80 °C保存。

务必记住，应根据干菌体重量，将对照菌株培养物与诱饵菌株培养物按一对一比例进行匹配。用含有1:2000蛋白酶抑制剂混合液的10毫升NP-40缓冲液重悬每个细胞沉淀。通过将一个离心管中的培养物直接倾倒入另一个离心管中，混合两种细胞培养物。

首先，将液氮倒入预冷的研钵中，待其完全蒸发。接着，向研钵中加入两毫升细胞。再倒入一些液氮以冻结细胞。

将细胞研磨至细腻的粉末状。重复此过程，直至所有细胞均被研磨完毕。务必防止细胞解冻。

必要时添加液氮。接着，将粉末转移至一个冰冻的烧杯中，并在室温下解冻。当边缘开始解冻时，在解冻后加入 20 毫升 NP-40 缓冲液，其中含有 1:200 的 PIC。

将粗裂解液转移至40毫升Nalgene离心管中，在Sovos SA 600转子中以16,000 RPM离心30分钟。等待期间，取300微升SROs two B珠子，用300微升NP-40缓冲液洗涤珠子三次。接着，将珠子重悬于300微升缓冲液中，使其形成1:1的悬浊液。

下一步是预清除细胞裂解液。首先，将上清液转移至新离心管中，加入 Spheros two B 珠。在4°C旋转摇床上孵育30分钟。

孵育的同时，取300微升IgG SROs六聚珠，用300微升NP-40缓冲液洗涤珠子三次。然后将珠子重悬于300微升缓冲液中，使其形成1:1的悬液。孵育结束后，离心收集SROs。

将两个珠子放入。将上清液转移至新管中。记得保存一部分细胞裂解液，用于后续的蛋白质印迹分析。

然后加入IgG磁珠。将内容物分装到两个离心管中，以促进更高效的结合，在4°C冰箱中于旋转平台上孵育两小时。孵育结束后，在4°C条件下将磁珠收集至层析柱中。

务必保存一份未结合组分的等分试样。用10毫升NP-40缓冲液洗涤磁珠。

接下来，用三毫升 TEVC 缓冲液洗涤磁珠。同样，记得保存一份磁珠的等分试样。

这将反映结合效率，以洗脱珠子。首先，将五微升 A-C-T-E-V 加入一毫升 TEVC 缓冲液中。将 TEVC 缓冲液加入珠子中并混匀。

将内容转移至两个1.5毫升EINOR离心管中，以实现更高效的混合，并在低温室中于旋转平台上过夜孵育。接下来，离心沉淀微珠，并将洗脱液转移至新的1.5毫升离心管中。洗涤后，用额外的0.5毫升TEVC缓冲液洗涤微珠。

将八份合并至一个离心管中。总体积应为1.5毫升的ELU八。保留一份TEV Elu八的等分试样用于沉淀。

用100%三氯乙酸（TCA）将等分试样调节至25% TCA。操作方法是将1.5毫升LU八分成两个各750微升的试管，向其中每个试管加入250微升100% TCA。

溶液应变为乳白色。接着，将溶液置于冰上30分钟。孵育后，定期涡旋混合物。

在4°C的冷室中，以最大速度在台式离心机中离心30分钟。用500微升含有0.05 N盐酸的冰冻丙酮洗涤一次。然后在4°C下以最大速度离心5分钟。

接着，加入500微升预冷的丙酮，洗涤一次，在4摄氏度下以最大速度离心5分钟。离心后，小心弃去丙酮，将沉淀干燥，用于银染。将沉淀重悬于50微升1倍的SDS上样缓冲液中。

如果计划将沉淀的蛋白质用于基于质谱的分析，则建议使用乙醇进行沉淀。操作步骤如下：首先加入20微克糖原，然后用100%乙醇将样品稀释五倍，并使用2.5摩尔的储备液将溶液调节至50毫摩尔碳酸氢钠，pH值调至5.0。通过倒置离心管混匀溶液。

室温下静置两小时。最后，将内容物分装到两个离心管中。在室温下以12,000 ×g 离心10分钟，使沉淀的蛋白质形成沉淀小球。

纯化过程中保存的等分试样应包含预清除的细胞裂解液、结合组分、未结合组分以及洗脱组分。我们建议使用抗TAP抗体进行Western印迹或银染法分析上述各等分试样中的蛋白质含量，以评估实验的结合与洗脱效率。在此银染凝胶中，纯化的SCS-TAP及其相互作用蛋白被检测到，并与无标签对照样品在该Western印迹中进行了比较。

通过使用抗TAP抗体进行Western印迹分析，检测了SCS-TAP纯化过程中不同组分。可见SCS-TAP在TEV蛋白酶切割洗脱后，迁移至较低的分子量位置，且洗脱后IgG磁珠上未残留SCS-TAP。这证实了该纯化过程具有很高的效率。

我们刚刚向您展示了如何通过IgG磁珠亲和纯化来纯化蛋白质复合物。在进行该实验步骤时，重要的是在开始纯化程序之前，务必根据干菌体重量匹配基础菌株和对照菌株。由于LAC能够为我们提供无偏且经确认的蛋白质结合伴侣的测量结果，因此我们仅进行TAP纯化的第一阶段，以尽量减少样品损失。

如果出现明显的非特异性结合，您可能需要执行完整的实验方案，该方案可在冷泉港实验手册中找到。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

嘿，来吧，mark。啊，走。