鉴定与定量蛋白质组学在酿酒酵母中的蛋白质复合物
March 4th, 2009
在这里，我们描述了一个新的量化确定在酿酒酵母中的蛋白质复合物的蛋白质组学技术。在这项研究中，我们一起串联质谱法，具有高特异性识别ER蛋白，Scs2p的具有约束力的合作伙伴的亲和纯化使用的SILAC方法。
该程序首先在含有 SLAC 对照菌株中的正常氨基酸以及重同位素赖氨酸和精氨酸的培养基中培养诱饵菌株。将等量的两种菌株混合并通过研磨和液氮裂解粗裂解物，首先通过离心机沉淀，然后通过与球珠结合清除。然后将细胞裂解物与 IgG 珠结合。
与 IgG 珠结合的蛋白质通过蛋白酶、裂解和沉淀来暗示。样品现在已准备好进行质谱分析。大家好，我是来自英属哥伦比亚大学生命科学研究所细胞环境生物学系 Lone Lab 的 Jesse Chao。
今天向您展示一种称为 silak 的定量蛋白质组学分析程序。结合亲和纯化。我们在实验室中使用该程序来研究蛋白质复合物。
那么让我们开始吧 在这个过程中，诱饵菌株包含正常的氨基酸，而 SLAC 对照菌株包含重同位素、赖氨酸和精氨酸。首先，首先种植一升，将诱饵菌株和控制菌株分别种植到屏幕上显示的值。接下来，将培养物倒入 500 毫升 Nalgene 离心管中。
平衡沉淀池中的负载，以 2， 580 RCF 倾析培养基并重悬沉淀。用 50 毫升冷 D H 2 O 将细胞转移至 50 毫升，离心管，离心管以在 3000 RCF 下沉淀细胞。此时，您可以将颗粒冷冻在零下 80 摄氏度。
重要的是要记住，对照菌株培养物与诱饵菌株培养物按干颗粒重量进行一对一匹配。将每个细胞沉淀重悬于 10 mL NP 40 缓冲液中，加入 1 比 2000 蛋白酶抑制剂混合物。将一根试管直接倾析到另一支试管中，混合两种细胞培养物。
首先开始研磨细胞，将液氮倒入预冷的砂浆中，使其完全蒸发。接下来，向砂浆中加入两毫升细胞。倒入一些液氮以冷冻细胞。
研磨细胞，直到细胞变细。粉。重复该过程，直到所有细胞都被研磨。确保不要让细胞解冻。
必要时添加液氮。接下来，将粉末转移到冰冷的烧杯中，并在室温下解冻。当边缘开始解冻时，在解冻后加入 20 毫升 NP 40 缓冲液和 1 至 200 PIC。
将粗裂解物转移至 40 mLL Nalgene 管中，并在 Sovos SA 600 转头中以 16， 000 RPM 的速度离心 30 分钟。等待时，取 300 微升 SRO 两个 B 珠，并在 300 微升 NP 40 缓冲液中洗涤珠子 3 次。接下来，将珠子重悬于 300 μL 缓冲液中，使其处于一对一的浆液中。
下一步是预清除细胞裂解物。首先，将超级 natin 转移到新试管中，并向 Spheros 添加两个 B 珠。在冷藏室的旋转平台上孵育 30 分钟。
孵育时，取 300 μL IgG SRO 6 个微珠，在 300 μL NP 40 缓冲液中洗涤微珠 3 次。然后将珠子重悬于 300 μL 缓冲液中，使其处于一对一的浆液中。孵育后，沉淀 SRO。
两个是珠子。将上清液转移到新试管中。请记住保存一份细胞裂解物的等分试样，以便以后进行蛋白质印迹。
然后添加 IgG 珠子。将内容物分成两管，以便更有效地结合，在冷藏室的旋转平台上孵育 2 小时。孵育后，将珠子收集在 4 摄氏度的色谱柱中。
请务必保存 unbound 派系的等分试样。用 10 毫升清洗珠子。NP 40 缓冲液。
接下来，用 3 毫升清洗珠子。TEVC 缓冲液。同样，记得保存一份珠子的等分试样。
这将反映结合洗脱珠子的效率。首先，将 5 微升 A-C-T-E-V 添加到 1 毫升 TEVC 缓冲液中。将 TEVC 缓冲液添加到珠子中并混合。
将内容物从更高效的混合中转移到两个 1.5 ml EINOR 管中，并在冷藏室的旋转平台上孵育过夜。接下来，旋转珠子并将洗脱液转移到新的 1.5 mL 试管中。洗涤后，用额外的 0.5 ml TEVC 缓冲液洗涤珠子。
将 8 个试管合并。您总共应该有 1.5 毫升的 ELU 8。保存 TEV Elu 8 的等分试样以沉淀。
将等分试样调整至含 100% TCA 的 25% TCA。为此，将 1.5 毫升的 LU 8 分成两管，每管 750 微升。向试管中加入 250 微升 100% TCA。
您的溶液应该变成乳白色。接下来，将其放在冰上 30 分钟。孵育后定期涡旋混合物。
在冷藏室的台式离心机中以最大速度旋转 30 分钟。用 500 微升含 0.05 正盐酸的冰冷丙酮洗涤一次。然后在 4 摄氏度下以最大速度旋转 5 分钟。
接下来，用 500 微升冰冷的、丙酮洗涤一次，然后在 4 摄氏度下以最大速度旋转 5 分钟。旋转后，小心去除丙酮并干燥沉淀以进行银染。将沉淀重悬于 50 μL 的 1 倍 SDS 样品缓冲液中。
如果您计划将沉淀的蛋白质用于基于质谱的分析，则建议使用乙醇进行沉淀。为此，首先加入 20 微克糖原，然后用 100% 乙醇稀释样品 5 次，并在 pH 值为 5.0 下用 2.5 摩尔原液调节至 50 毫摩尔碳酸氢钠。通过倒置试管混合溶液。
在室温下静置 2 小时。最后，将内容物分成两个 einor管。在室温下以 12， 000 GS 离心 10 分钟，使沉淀的蛋白质沉淀。
在纯化过程中保存的等分试样应包括预先澄清的细胞裂解物、结合组分、未结合组分和逃脱组分。我们建议使用 Antit TAP 抗体或银染通过 Western 印迹分析上述等分试样的蛋白质含量，以反映实验的结合和洗脱效率。在这种银染凝胶纯化的 SCS 两个水龙头相互作用时，伙伴被可视化并与该蛋白质印迹中未标记的对照进行比较。
使用 Antit tap 抗体通过 Western 印迹分析在 SCS 两个水龙头纯化过程中采取的各种派别。请注意，SCS two tap 在 TEV 蛋白酶切割后以较低的分子量迁移，并且洗脱后 IgG 珠上没有留下 S SCS two tap。这证实了纯化是高效的。
我们刚刚向您展示了如何通过使用 IgG 微珠进行亲和纯化来纯化蛋白质复合物。执行此程序时，请务必记住，在开始纯化程序之前，请确保将基础菌株和对照菌株与干 pelle 重量相匹配。由于 LAC 为我们提供了蛋白质结合伴侣的无偏差和快速测量，因此我们只进行 tap 纯化的第一阶段，以最大限度地减少样品损失。
如果您遇到大量非特异性结合，您可能希望执行整个方案，该方案可在冷泉港手册中找到。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
嘿，来吧，马克。啊，走吧。
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概述
本文介绍了一种定量蛋白质组学技术，用于识别酿酒酵母中的蛋白质复合物。该研究采用SILAC方法结合亲和纯化和串联质谱分析，以确定ER蛋白Scs2p的结合伙伴。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质组学
- 细胞生物学
- 质谱分析
背景
- 理解蛋白质相互作用对于阐明细胞功能至关重要。
- SILAC（稳定同位素标记氨基酸细胞培养）是一种用于定量蛋白质组学的强大方法。
- 亲和纯化技术提高了蛋白质复合物鉴定的特异性。
- 串联质谱分析允许对蛋白质相互作用进行详细分析。
研究目的
- 开发一种用于酵母中鉴定蛋白质复合物的稳健方法。
- 调查ER蛋白Scs2p的结合伙伴。
- 提高蛋白质组学分析的特异性和灵敏度。
使用的方法
- 在含有正常和重同位素氨基酸的培养基中培养诱饵菌株。
- 混合和裂解菌株以获得粗裂解液。
- 使用球形珠清理裂解液并结合IgG珠。
- 从IgG珠上洗脱蛋白质以进行质谱分析。
主要结果
- 成功鉴定了Scs2p的结合伙伴。
- 证明了SILAC方法在蛋白质组学中的有效性。
- 在蛋白质复合物鉴定中实现了高特异性。
- 洞察了Scs2p在细胞过程中的作用。
结论
- 开发的技术增强了对酵母中蛋白质相互作用的理解。
- 研究结果为蛋白质组学和细胞生物学的更广泛领域做出了贡献。
- 未来的应用可能扩展到其他生物体和蛋白质复合物。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative proteomics enables unbiased identification of protein interaction networks, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By distinguishing specific binding partners from contaminants through isotopic labeling, the method enhances predictive confidence in protein complex analysis. This approach addresses a key challenge in studying membrane contact sites and lipid trafficking mechanisms relevant to cellular signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping protein-protein interactions at ER-PM membrane contact sites.
- Operational Value: Reduces false positives through SILAC-based quantification, improving target validation reliability.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by clarifying the molecular composition of lipid trafficking complexes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining the protein composition of ER-PM MCSs.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative interaction data suitable for assay standardization and scalability.
- Scientific Value: Facilitates preparation of disease-relevant models by identifying conserved eukaryotic proteins involved in lipid signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides mechanistic insights into lipid trafficking and signaling, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through reproducible complex identification across experimental replicates.
- Scientific Value: Supports preclinical model development by defining conserved protein complexes in yeast applicable to higher eukaryotes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing quantitative interaction data that informs target prioritization and pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying Scs2p interaction partners in lipid trafficking networks.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein interaction profiles with quantitative readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Enables condition comparison through SILAC-based quantification, allowing teams to distinguish specific binding from background noise.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by identifying conserved eukaryotic proteins involved in membrane contact site function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics platform for studying protein complexes across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized SILAC labeling and affinity purification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative interaction data that reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated interaction network confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in quantitative proteomics, mass spectrometry, and yeast culture techniques.
- Depends on instrumentation for SILAC labeling, affinity purification, and high-resolution LC-MS/MS analysis.
- Necessitates cross-team standardization of labeling efficiency, lysis protocols, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-yeast model systems or alternative lysis conditions.
- Includes practical limitations related to the dynamic range of detection and the need for high-abundance bait expression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:45
Introduction
1:17
Preparation of the Bait and SILAC Control Strain
2:44
Grinding of Cells
4:05
Pre-clearing Cell Lysate
5:51
Eluting From IgG Beads by TEV Protease Cleavage
6:45
Trichloroacetic Acid (TCA) Precipitation
9:00
Sample Analysis by Western Blotting and/ or Silver Staining
8:11
EtOH/ Acetate Precipitation
9:30
Representative Results/ Outcome
10:15
Conclusion
