平滑肌中局灶性 Ca²⁺ 瞬变的检测

首先，配制钙负载溶液，并将其加热和通气。取出膀胱，切开后展平并用针固定，取一段逼尿肌。将逼尿肌条放入负载溶液中，孵育并冲洗，然后展平固定。

组织内钙信号的荧光通过激光激发，并捕获所产生的发射光。通过比较连续的图像帧来分析由单帧组成的视频。扣除背景信号。

细胞边缘阈值决定了事件可能出现的位置，并计算连续大脑图像之间的比值。如果剩余的事件符合预设标准，则会被高亮并标记。您好，我叫 John Young，来自牛津大学药理学系 Keith Brain 和 Tom Kinane 的实验室。

我是 Rob Amos，也来自 Brain 与 Canne 实验室，这位是 Keith Brain。今天，John 和 Rob 将向您展示一种在平滑肌中进行钙成像的技术。我们在实验室中使用该技术来研究自主神经末梢神经递质的释放及其对平滑肌的影响。

那么我们开始吧。钙离子指示剂Fluo-4 88 BAFTA 1:00 AM为每支500微升的瓶装，内含50微克粉末。配制钙离子指示剂时，先向粉末中加入40微升Onic F1 27溶液，轻轻振荡30秒；随后加入460微升生理盐水溶液（PSS），再轻轻振荡30秒。

最终溶液为10微摩尔的Organ Green。4 88 BAFTA 1:00 AM可提供四份等量样品，每份125微升。避免光照，并在解剖目标组织前将溶液置于负20摄氏度保存。

将钙离子指示剂从冷冻箱中取出，在室温下解冻，同时保持钙离子指示剂处于避光状态。取1 mL PSS溶液加入试管中，并将试管置于33摄氏度的水浴中。用橡胶塞将通气管固定在试管中，也可使用通气针，然后以每秒约一个气泡的速度通入95%氧气与5%二氧化碳的混合气体。

从动物体内解离出平滑肌器官。本实验中为小鼠的膀胱。将器官置于约50毫米的PSS中冲洗。组织清洗后，仔细去除膀胱周围的脂肪组织和结缔组织。

按照泌尿膀胱的平滑肌劳里安型进行解剖。从膀胱颈开始，沿纵行方向切开，由尾端至穹顶顶部。在头端背侧表面，沿主要肌束走向制备四条长6至8毫米、宽1至2毫米的组织条。

将解剖后的组织与预先加温并通入气体的PSS混合，向试管中的组织加入125微升浓度为10微摩尔的Organ Green 488B，在室温下避光孵育1小时。用手轻轻振荡以混匀。将试管放回水浴槽中，恢复通气，并用铝箔覆盖水浴槽。

组织充分摄取钙离子指示剂所需的时间因组织大小和光滑肌层厚度而异。例如，小鼠膀胱逼尿肌和大鼠输精管的孵育时间为70分钟，而大鼠膀胱逼尿肌和小鼠输精管深部组织则需要孵育120分钟。

组织加载钙离子指示剂后，即可进行显微镜观察前的准备。首先，用持续通气的PSS溶液冲洗组织10分钟。接着，将组织置于内衬S型护栅的制备皿中。

轻轻拉伸以形成平整的薄片。使用较短的金属丝将组织固定，例如直径为25至50微米、长2毫米的银丝，并以一定角度插入固定针。

避免使用长度超过几毫米的图钉，因为它们可能会划伤物镜。仔细固定组织对于减少组织的自发移动以及便于定位合适的成像位置至关重要。组织固定完毕后，将样本培养皿置于显微镜载物台上。

注意防止PSS从培养皿中硅胶防护线区域溢出，因为这可能导致PSS覆盖较大区域。出于演示目的，当开始灌流时，以下步骤将在光照条件下进行。

请注意，这些实验通常在黑暗条件下进行。开启泵以对制备样品进行灌流。使用PSS时，常用流速为100毫升每小时。

打开加热装置，将进液管、出液管和温度探头放置于固定装置的培养皿中，并利用其底部的磁铁将各管固定在金属条上。出液管尖端的高度将决定生理盐溶液（PSS）的深度。注意确保出液管确实在排出PSS，因为有时可能并未有效排出。

首先将加热装置的温度设定为达到33至35摄氏度之间的目标温度。使用低倍物镜使组织至少平衡10分钟。重复10至20次。

使用落射荧光或蓝光激发来观察平滑肌，并确定一个合适的监测区域。由于激发光照会导致指示剂发生光漂白，因此每次观察时间应避免超过几秒钟。

避免选择具有明亮结构的区域，因为这些结构可能导致图像检测算法出现大量假阳性结果。应尽量选择运动较少且视野中平滑肌细胞数量较多的区域。选定成像区域后，切换至更高倍率的物镜，例如 40 x。

旋转载物台或光轴，使平滑肌细胞呈水平方向，即与快速扫描轴平行。此时平滑肌细胞已准备好进行共聚焦显微镜成像。

在本实验方案中，我们使用 Leica SP 两台直立共聚焦显微镜。将针孔关闭至一个艾里斑大小。在定制光学可调滤光片上，将激光功率设置在 25% 至 35% 之间。

该数值在亮度和光漂白之间进行权衡。为准备数据分析，请下载并安装 ImageJ。下载适用于您操作系统的版本，然后通过下载最新的 ImageJ jar 文件替换原有文件，以更新至最新版本。接着，下载 Excel Writer jar 文件，并将其安装到插件 jar 目录中。

将这些文件复制到插件目录中。使用插件宏安装每个脚本。通过我们使用的徕卡SP2共聚焦显微镜配套软件Leica的Image J安装功能进行安装。

LCS 将每个序列的各个帧保存为单独的文件。要重建该序列，请确保所有需要重建的帧都位于同一个文件夹中。

例如，数据文件夹中的 tiffs。然后从插件宏菜单中选择 Leica SP 两个堆栈宏。在此情况下，选择根目录数据文件夹。

从下拉列表中选择所需的文件夹。在本例中，tiffs 选择一个输出目录或创建一个新的目录。例如，数据文件夹堆栈。

然后，该脚本将通过将单个帧重新组合为序列，以校正运动伪影。我们使用一种 freely available 的算法，对序列下载堆栈中的帧进行配准或匹配，即 rig 和 turbo reg。将各自的文件复制到 stacks 文件夹中。

加载一个待处理的图像序列，然后移动到一个能清晰显示目标区域的帧。其他帧将以此参考帧为基准进行对齐。随后，进入插件菜单中的图像序列功能。

叠加配准。尝试不同的变换方法，以确定对每个位点最有效的方案。影响钙瞬变检测的成像因素将因各检测位点的特定性质和颗粒参数而异。

检测的灵敏度和特异性得到提高。因此，对于每个位点，我们将计算用于比值的减法阈值以及细胞边缘阈值。首先，进入插件，宏，安装，并选择 jn CTO dot oh eight release dot IJM JM。然后进入插件宏加载堆栈。

选择一个系列并计算以下颗粒参数。为计算相减图像的阈值，请在您认为是背景的区域上选择一个矩形兴趣区域进行测量，并记录其平均值。为计算比值图像的阈值，请在平滑肌细胞或细胞群中光学平坦的区域周围选择一个矩形兴趣区域。

测量并记录均值和标准差。重复该过程两次，或按住 Shift 键一次性绘制三个方框。计算并记录比值的阈值。

计算方法为：标准差除以均值后加1，再将结果乘以32。对三个重复样本的数值取平均，乘以32这一系数是为了匹配比值算法，其中相对于前一帧无变化的情况被映射为整数值32。该系数提供了良好的动态范围，以检测比值的升高和降低。

对于八位图像，选择图像调整阈值。选择黑白模式。在上限滑块下方进行定义，并记录相应的数值。

此区域位于滑块右侧。仅黑色区域内的事件将被计入。单击重置。

现在，减去的比值阈值和细胞边缘阈值已经计算完成，我们可以开始分析图像堆栈。确定待分析堆栈的位置。在此阶段仅选择一个系列。

这是第一个文件，最后一个文件应与此相同。然后选择数据文件和堆栈的输出位置。例如，选择数据文件夹作为输出目录。

输入用于减去比值阈值和设定边缘阈值的阈值数值。其余设置保持默认值。该算法将生成一个双窗格窗口，其中左侧显示处理后的序列，右侧显示原始序列。

从输出文件夹中打开此文件，并仔细检查以评估假阳性事件的数量，以及肉眼可见但未被算法检测到的事件情况。对于每个序列，算法会生成一个 Excel 文件，详细列出所检测事件的特征，例如幅值、面积和位置；通过回顾算法输出的图像文件所识别出的假阳性事件，可手动从此 Excel 文件中删除，但应严格把握删除标准。

这是一段关于平滑肌中钙瞬变的影像。在此示例中，该影像由以5赫兹采集的100个单独帧组成。在实验中，例如研究某种特定药物对钙瞬变频率的影响时，我们会采集大量此类影像。

此处可见平滑肌细胞中存在大量自发性钙瞬变。图中显示了颗粒检测算法的结果。对于每个序列，该算法会生成一个 Excel 文件，详细记录所检测到事件的特征，例如振幅、面积和位置。

我们已经展示了一种用于成像平滑肌器官（如膀胱）中钙瞬变的方法，并且展示了如何使用实验室开发的算法来分析这些钙瞬变。需要牢记的关键点是，必须为钙成像做好充分的组织准备。以我们今天所演示的组织为例，这包括去除结缔组织以及可能遮挡视野的任何脂肪组织。

将组织固定成平整的片状也很重要。祝您的实验顺利，感谢观看。