斑马鱼晶状体移植及其在眼突变体分析中的应用

首先，将表达GFP的转基因斑马鱼供体与野生型斑马鱼受体分别置于含有无钙斑马鱼林格溶液的培养皿中，各自孵育30分钟。随后，将鱼体幼虫嵌入低熔点琼脂糖中，排列成两条平行的线：A线用于供体，B线用于受体。对于供体，完整摘除整个眼睛；而对于受体，则仅移除晶状体。

在将供体晶状体植入受体眼之前，需去除其周围的组织。移植后，将鱼置于贴有标签的24孔板中饲养。移植的晶状体应在受体中显示出GFP荧光。

自然情况下，宿主的对侧眼未经过手术操作，也不表达GFP。大家好，我是Yj。我是Kaya McCullough，我们来自哈佛医学院眼科系Yma Maki博士的实验室。今天我们将向您展示一种在野生型斑马鱼Daniel Rio中进行晶状体移植的实验方法。

我们在实验室中使用此方法将晶状体从野生型动物移植到突变型动物，反之亦然。这使我们能够确定突变基因在晶状体中是自主发挥作用还是非自主发挥作用。现在让我们开始。

斑马鱼品系在标准的鱼类养殖条件下维持，温度为28.5°C，光照周期为14小时光照、10小时黑暗。在计划实验的前一晚，将雄鱼和雌鱼放入同一鱼缸中，并用隔板将它们彼此分开。这些鱼的基因型应能产生表达GFP及任何目标突变的子代。同时，在一小时内采用相同的操作流程，设置非转基因野生型动物之间的交配组合。

早晨灯光亮起后，移除隔板以允许鱼类交配。15至30分钟后，将鱼缸中的水倒入滤网中收集胚胎，然后用洗瓶中的胚胎培养水冲洗，转移至一个100毫米×15毫米的培养皿中。随后用移液器吸除受精胚胎上的残留物及任何杂质，以清洁卵子。

将旧的卵水更换为新的卵水。在进行晶状体移植前，可将胚胎保存在28.5°C的培养箱中。当准备进行移植时，需通过手动方式去除胚胎的卵膜以准备胚胎。

使用金属探针和一对镊子，去壳的胚胎现在必须在无钙ZFR中加入0.2% EDTA，于30分钟内孵育。孵育期间，可准备解剖所需针具。移植操作需要使用锋利的针头来切割晶状体周围组织以及来自agros的Woolies胚胎。

还需要使用钝头针移动供体晶状体，并将其插入受体中。首先用钻石刀切断巴斯德移液管的尖端。然后将玻璃毛细管插入巴斯德移液管的尖端，使其约一半长度位于其中。使用火焰小心地将一根细钨丝插入毛细管的开口端。

用镊子夹住玻璃管的一端，在金属丝上加热使其熔化，同时扭转针的另一端。软化的玻璃应螺旋缠绕在金属丝上，将其固定。由此制成钝头针，用于制作锐利的针头。

将钨丝置于火焰上灼烧1至1.5分钟，烧去金属部分，以形成非常细的尖端。通过显微镜检查尖端的质量。

一个好的针尖不应弯曲或变形，应平滑地收细至一个精细的尖端，直径不超过50微米。将两根针在火焰上灼烧数秒以灭菌，并在操作前冷却。在塑料离心管中，准备好预热至40°C的1.2%低熔点琼脂糖和无钙ZFR溶液。用巴斯德吸管吸取供体胚胎，缓慢将其排入含有琼脂糖的离心管中。将胚胎在琼脂糖中孵育约五秒钟。

用移液管小心缓慢地将胚胎取出，并将其排列在直径100毫米的聚苯乙烯培养皿中成一行，大多数胚胎会侧躺，眼睛朝上。接着对宿主卵重复此操作，并将其平行排列在供体卵的旁边，确保在琼脂凝固前完成。使用钝头针调整任何方向不正确的胚胎，使眼睛在琼脂凝固后朝上。

用0.2%低熔点琼脂糖溶液覆盖。使用锋利的针头，去除眼睛周围的琼脂糖，并非常小心地切下整个供体眼球，使其漂浮。接下来，将晶状体从眼球中释放出来。

此操作需将针头从下向上穿过眼球组织。仅适用于宿主。使用锋利的针以小幅度动作切除晶状体，尽可能靠近晶状体边缘切割，但不得撕裂晶状体。

避免从宿主眼球的其他部分移除过多组织。一旦游离，晶状体会在培养基中漂浮。使用钝针小心地将供体晶状体推至宿主晶状体位置的稍上方，然后用钝针将其轻轻推入到位。

可弃去宿主晶状体。将供体和宿主胚胎置于1.2%Aros中30至60分钟。胚胎培养基有助于伤口愈合。

然后使用锋利的金属针从琼脂中释放出胚胎。将胚胎转移至含有胚胎培养基的24孔板中。每个胚胎应单独占据一个孔。

确保正确标记孔板，以便在晶状体移植完成后能清楚区分每个受体对应的供体。将胚胎置于28.5°C条件下培养至所需时间。对于表型观察，我们通常在移植后一至两天内检查晶状体的分化情况。

移植到宿主眼睛后，供体来源的晶状体应维持 GFP 表达。如果在野生型环境中突变表型未得到挽救，则表明该表型是细胞自主性的；然而，如果表型得到挽救，则认为该表型为非细胞自主性的。

这对底层基因的功能具有重要意义。我们刚刚向您展示了如何在斑马鱼胚胎中进行晶状体移植。进行此操作时，务必小心制作针具的形状以及仔细分离晶状体本身。

此外，在移植完成后，应在卵子发生滚动前迅速将胚胎排列好。为避免忘记添加胚胎，需将培养基补充至八孔板的愈伤组织中。就这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。