Name: 剖析在非人类灵长类动物脑立体定向空间 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-16T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学习在非人类灵长类动物脑立体定向空间中进行冠状切片制备的方法。该流程包括将猴头固定于立体定位仪、使用操纵臂进行连续冠状切片、测量脑组织并进行冷冻保护，为神经科学研究提供标准化的脑组织处理技术。

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作者感谢 Ikiel Ptito 提供的持续技术支持。MP 获得 NSERC 基金资助。

第1部分：组织的预处理
<ol>
<li>组织应使用多聚甲醛、戊二醛或福尔马林充分灌注。可通过常用于获取其他器官的标准经心脏灌注法实现。在本研究中，受试对象首先通过肌肉注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）进行深度镇静，随后静脉注射过量戊巴比妥钠（25 mg/kg）实施安乐死，并经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全放血。随后用PBS配制的4%多聚甲醛溶液灌注5分钟（约1升）。</li>
</ol>
第二部分：立体定位切块
<ol>
<li>在将头部放入立体定位仪框架之前，需先确定霍斯利-克拉克/耳间平面的零点坐标。该平面为两耳之间的理论中点。测量此平面时，需将耳杆在装置中对称安装，然后将手术刀片固定于立体定位操纵臂上，测量两耳杆之间的中点位置。此步骤对于根据研究需求确定组织切块位置至关重要。完成测量后，需对颅骨进行处理，以便将其固定于立体定位装置中。</li>
<li>为将头部放入立体定位仪框架，需使用骨剪和手术刀去除下颌骨。同时，需去除皮肤、肌肉和结缔组织，以充分暴露颅骨。在去除颅骨上的结缔组织后，通过凿除颅顶骨（包括枕骨的板状部分以及顶骨和额骨）来暴露脑组织。在本实验中，部分颅顶骨已预先去除。操作时需注意避免完全去除颞骨，因为耳道必须保持完整，以便将头部固定于立体定位仪框架中。随后应清除暴露脑组织表面残留的硬脑膜。此时颅骨已准备就绪，可进行立体定位仪固定。</li>
<li>按照立体定位手术的标准操作方式，调节眼眶、腭部和耳杆，确保头部在立体定位装置中牢固固定。将立体定位操纵臂移至预设的前后（A/P）坐标位置，并将其移动至脑组织的一侧。缓慢将刀片插入脑组织，完全提起刀片后，再向内侧移动并再次下插刀片。重复此两步操作，直至刀片到达对侧半球的外侧边缘，完成第一个冠状切块。后续冠状切块操作中，将操纵臂沿A/P轴方向移动1 cm，重复上述步骤，直至整个脑组织被完全切块。</li>
</ol>
第3部分：从颅骨中取出大脑
<ol>
<li>将头部从立体定位仪框架上取下，用手掌托住暴露的大脑。尝试用手掌轻柔地固定大脑，并将小指置于额叶上方，以尽量减少大脑在颅腔内的移动。为防止脑表面软脑膜干燥，可用磷酸盐缓冲液（PBS）浸湿的纱布覆盖大脑表面。牢固握住颅骨，凿除剩余的枕骨和颞骨以及脊柱部分，从而暴露大脑的基底部和侧面。最后去除残留的额骨和鼻骨，以便暴露嗅球。需要注意的是，应最后去除额骨，因为在去除颅底骨时大脑会轻微移动，若额骨过早去除，其锋利的边缘可能损伤额叶。剪除并清除残留的硬脑膜。小心抬起大脑前部，将手术刀滑入大脑下方，将大脑从颅骨中分离取出。</li>
</ol>
第4部分：测量
<ol>
<li>在冷冻前可进行多项有用的测量。例如，使用卡尺测量脑的前后轴（A/P轴）。此外，可通过称量脑组织重量，利用量筒中水的排开体积测量其体积，然后将重量除以排开的体积来计算其密度（见表1）。</li>
</ol>
第5部分：完成脑组织的封闭。
<ol>
<li>通常情况下，当手术刀片插入大脑时，其长度不足以完全穿透大脑背侧至腹侧的全部范围。在取出大脑并获取大体测量数据后，使用组织切片刀继续切割，直至完成大脑腹侧的取材（图2）。</li>
<li>在冷冻组织块之前，需将其置于梯度PBS缓冲蔗糖溶液（10%、20%和30%）中进行低温保护处理，并在4˚C条件下保存，直至脑组织完全沉底。组织块通常需要在10%蔗糖溶液中孵育过夜，在20%溶液中孵育2-3天，再在30%溶液中继续孵育3-5天方可沉底。建议每天更换一次30%蔗糖溶液。</li>
</ol>
第6部分：代表性结果
大脑从颅骨中取出后，可进行多项大体形态学测量，包括前后径长度、重量和特定密度（表1）。我们通常将大脑切成6-7个大小为1 cm的组织块（图1）。每个组织块随后进行拍照（图2），并可根据研究需要进一步解剖，或用梯度蔗糖溶液处理后冷冻保存。
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td> 样本</td>
<td>前后长度 (mm)</td>
<td>重量 (克)</td>
<td>排水量 (ml)</td>
<td>比重 (g/ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>O2303-2-1-1</td>
<td>64.3</td>
<td>28.1</td>
<td>24</td>
<td>1.171</td>
</tr>
<tr>
<td>O5180-1</td>
<td>71.3</td>
<td>38.7</td>
<td>34</td>
<td>1.138</td>
</tr>
<tr>
<td>O2708-3-1</td>
<td>62.8</td>
<td>28.7</td>
<td>26</td>
<td>1.104</td>
</tr>
<tr>
<td>O9184-4-2</td>
<td>65.3</td>
<td>29.5</td>
<td>24</td>
<td>1.229</td>
</tr>
<tr>
<td>N459-1-14-2</td>
<td>68.2</td>
<td>31.6</td>
<td>26</td>
<td>1.215</td>
</tr>
<tr>
<td>平均值</td>
<td>66.38</td>
<td>31.32</td>
<td>26.8</td>
<td>1.171</td>
</tr>
<tr>
<td>标准差</td>
<td>3.38</td>
<td>4.33</td>
<td>4.17</td>
<td>0.052</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表1. 5个月大绿猴右半脑的大体形态学测量数据
<img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig1.jpg" alt="用于神经科学研究的大脑解剖图，含显示大脑皮层结构的比例尺。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 1"> <img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig2.jpg" alt="大脑解剖图；侧视图并标有切片区段，用于神经科学研究与分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 1.5"> 图1. 用于脑组织切块的冠状面示意图。 此为一只成年绿猴外置大脑的示例。图中展示了切块操作的实例，垂直线间距为1 cm，通常可从每个半球获得7个冠状切块。
<img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig3.jpg" alt="脑解剖，标尺用于比例参照，关于脑结构比较的教育研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 图2. 立体定位空间中的脑组织块。每个组织块可获得约200个50µm厚的切片。按照此取样方案，在冠状面上切片时，大脑皮层将获得超过1200个切片，小脑额外获得400–500个切片。

<ol><li>Gallagher, M., Rapp, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+animal+models+to+study+the+effects+of+aging+on+cognition.+Annu+Rev+Psychol+48%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48.</a> , 339-370 (1997).</li>
<li>Clancy, B., Darlington, R., Finlay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+developmental+time+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li>
<li>Nowakowski, R. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+site+of+origin+and+route+and+rate+of+migration+of+neurons+to+the+hippocampal+region+of+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The site of origin and route and rate of migration of neurons to the hippocampal region of the rhesus monkey.</a> J Comp Neurol. 196, 129-154 (1981).</li>
<li>Rakic, P., Bourgeois, J. P., Eckenhoff, M. F., Zecevic, N., Goldman-Rakic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+overproduction+of+synapses+in+diverse+regions+of+the+primate+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Concurrent overproduction of synapses in diverse regions of the primate cerebral cortex.</a> Science. 232, 232-235 (1986).</li>
<li>Granger, B., Tekaia, F., Le Sourd, A. M., Rakic, P., Bourgeois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tempo+of+neurogenesis+and+synaptogenesis+in+the+primate+cingulate+mesocortex%3A+comparison+with+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tempo of neurogenesis and synaptogenesis in the primate cingulate mesocortex: comparison with the neocortex.</a> J Comp Neurol. 360, 363-376 (1995).</li>
<li>Zecevic, N., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+layer+I+neurons+in+the+primate+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of layer I neurons in the primate cerebral cortex.</a> J Neurosci. 21, 5607-5619 (2001).</li>
<li>Ervin, F. R., Palmour, R. M., Young, S. N., Guzman-Flores, C., Juarez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voluntary+consumption+of+beverage+alcohol+by+vervet+monkeys%3A+population+screening%2C+descriptive+behavior+and+biochemical+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Voluntary consumption of beverage alcohol by vervet monkeys: population screening, descriptive behavior and biochemical measures.</a> Pharmacol Biochem Behav. 36, 367-373 (1990).</li>
<li>Palmour, R. M., Mulligan, J., Howbert, J. J., Ervin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+monkeys+and+men%3A+vervets+and+the+genetics+of+human-like+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Of monkeys and men: vervets and the genetics of human-like behaviors.</a> Am J Hum Genet. 61, 481-488 (1997).</li>
<li>Boire, D., Théoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+evaluation+of+neurons+and+glia+in+the+monkey+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+following+an+early+cerebral+hemispherectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Stereological evaluation of neurons and glia in the monkey dorsal lateral geniculate nucleus following an early cerebral hemispherectomy.</a> Exp Brain Res. 142, 208-220 (2002).</li>
<li>Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Redmond, D. E. J. r, Elsworth, J. D., Roth, R. H., Cornelius, S. K., Snyder, E. Y., Sladek, J. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cells+migrate+along+the+nigrostriatal+pathway+in+a+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease.</a> Exp Neurol. 211, 362-369 (2008).</li>
<li>Lemere, C. A., Beierschmitt, A., Iglesias, M., Spooner, E. T., Bloom, J. K., Leverone, J. F., Zheng, J. B., Seabrook, T. J., Louard, D., Li, D., Selkoe, D. J., Palmour, R. M., Ervin, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+abeta+vaccine+reduces+central+nervous+system+abeta+levels+in+a+non-human+primate%2C+the+Caribbean+vervet%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease abeta vaccine reduces central nervous system abeta levels in a non-human primate, the Caribbean vervet.</a> Am J Pathol. 165, 283-297 (2004).</li>
<li>Mash, D. C., Staley, J. K., Doepel, F. M., Young, S. N., Ervin, F. R., Palmour, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+dopamine+transporter+densities+in+alcohol-preferring+vervet+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Altered dopamine transporter densities in alcohol-preferring vervet monkeys.</a> Neuroreport. 7, 457-462 (1996).</li>
<li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

圣基茨绿猴（Chlorocebus aethiops sabeus）是一种旧大陆灵长类动物，其大脑皮层和皮层下结构的发育模式与速率与人类相似。该物种已被用于模拟多种复杂的人类行为障碍，如焦虑行为、高血压8、半球切除术9、帕金森病10、阿尔茨海默病11以及酒精滥用12。最近，该物种还被用于研究自然状态下产前乙醇暴露对神经解剖结构的影响。在妊娠晚期，允许怀孕的绿猴每周四次饮用相当于3至5个标准饮酒单位的酒精，我们发现其额叶皮层的神经元数量减少了35%13。本研究中，脑组织通过立体定位法进行取材，仅需对7个脑块中的3个进行切片，即可完成对额叶皮层的体视学评估。这种技术不仅限于非人灵长类动物的大脑，也可推广应用于啮齿类动物的大脑。例如，若研究关注的是大鼠的体感皮层，则可使用啮齿类动物立体定位仪，在该区域的前后位置进行立体定位切割。这样可限定切片范围，并确保不同动物之间具有标准的冠状切面。需要注意的是，在使用立体定位操作仪进行任何内侧-外侧移动之前，必须先将刀片完全从脑组织中撤回，否则刀片将不必要地...

<table><tbody><tr><td>手术刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>任何外科剪刀均可满足要求</td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织切片刀</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在立体定位空间中解剖非人灵长类动物大脑

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

使用非人灵长类动物为我们理解人类的发育和衰老过程提供了一个极好的转化模型1-6此外，近年来利用非人灵长类动物为自然模拟酒精滥用等复杂的精神疾病提供了机会7. 本文介绍一种在绿猴冠状面上进行脑组织切片的技术（Chlorocebus aethiops sabeus) 在立体定位空间中的完整颅骨内。此处描述的方法可在不同组织块和不同受试者之间提供标准的切片平面，并最大限度地减少组织块之间的部分切片。以冠状面切片方式切割组织块还有助于清晰界定感兴趣区域。由于采用该方法所获得的组织块尺寸适中，例如，仅一只绿猴的单侧大脑半球在50μm厚度切片时即可产生超过1200张切片。此外，将脑组织分割为1cm大小的组织块，有利于蔗糖充分渗透以实现冷冻保护，并使组织块能够在标准冷冻切片机上进行切片。

非人灵长类动物是我们理解大脑正常功能的重要转化研究物种。灵长类动物大脑的解剖结构可为人类正常及病理状态提供重要的研究依据。

非人灵长类动物的使用为我们理解人类的发育和衰老过程提供了极佳的转化医学模型1-6。在……

该操作从一个灌注良好的猴头开始。去除颅盖后，将头部置于立体定位仪框架中，利用操纵臂进行一系列立体定位冠状切面切割，随后取出脑组织，测量并进行冷冻保护。大家好，我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室的 Dr. Mark Burke。我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室的Shaheen Zur博士。我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室主任Mo Petto博士。今天我们将向您展示一种在立体定位空间中固定非人灵长类动物脑组织的实验操作流程。我们在实验室中采用此方法研究正常发育过程中以及发育受到干扰时大脑结构的各个方面。现在让我们开始。本方案从非洲绿猴安乐死后进行固定和断头开始。在取出脑组织之前，必须先准备好立体定位仪。首先需要确定霍斯利-克拉克耳间平面零点的坐标，或理论上的双耳中点。为了测量该平面，需将耳杆等量地安装到仪器中。然后将手术刀片安装到立体定位仪的操作臂上，并测量耳杆之间的中点。接着，准备将头部放入立体定位仪框架中。使用骨钳和手术刀去除下颌骨。此时，逐步剔除残留的颅骨碎片。注意不要移除颞骨，因为后续需要完整的耳道来将头部固定在立体定位仪上。使用镊子和剪刀，小心剪除暴露脑组织表面可见的硬脑膜。现在颅骨已准备好放入立体定位仪中。开始对脑组织进行立体定位切块时，将头部置于框架内，调整眼眶固定板和耳杆，其方式与立体定向手术相同。将立体定位仪置于预先确定的前-后（AP）轴方向上。开始对脑组织进行切块。将操作臂移至脑组织的最左侧或最右侧，降下刀片进行首次切割。刀片应垂直于脑中线，在冠状面上进行切割。将刀片抬起，完全离开脑表面。然后向内侧移动，使其刚好与第一次切口重叠，再放下刀片。重复此操作，持续进行重叠切割，直至到达脑的对侧边缘。至此完成第一个冠状面切块。将操作器沿前后轴向前或向后移动一厘米，并在冠状面内进行另一组与之前平行的切片。以此方式继续操作，直至将整个脑组织切块完毕。完成切割后，现在可以将脑组织从颅骨中取出。首先，将头部从固定架上取下。尝试用手掌轻轻托住脑组织，以防止脑组织在颅骨内晃动而受损。用小指压住额叶，防止脑组织表面干燥。用 PBS 浸湿一块纱布并覆盖在脑组织上。用手牢固握住颅骨，凿除剩余的枕骨和颞骨以及脊柱部分。这将暴露大脑的基底部和外侧部分。接下来，去除残留的硬脑膜。最后，移除鼻骨及任何残留的额骨，以便暴露嗅球。去除额骨非常重要。最后，因为当你移除颅底时，脑组织会轻微移动，而额骨的锯齿状边缘可能会损伤额叶。小心地去除残留的硬脑膜，抬起脑的前部，将手术刀滑入脑下方，使脑与颅骨分离。由于切割刀片未完全到达腹侧，脑组织会像沿茎切开的洋葱一样保持完整。在冷冻脑组织之前，可进行多项有用的测量。首先，可以使用游标卡尺测量脑的前后轴（AP轴）。接着，测定其特定密度并称量脑组织的质量。然后，通过排水法在量筒中测量其体积。现在你已得到密度，即质量

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