Name: 知道重要的:无偏体视学在非人类灵长类动物的脑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学习无偏体视学方法，利用光学分切器精确估算非人灵长类动物特定脑区的神经元数量。该技术结合立体定位图谱与显微镜系统，为神经解剖学和脑疾病研究提供可靠的细胞计数数据。

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作者感谢 Ikiel Ptito 提供的持续技术支持。MP 获得 NSERC 基金资助。

第1部分：组织预处理应按照Burke等（2009）的方法进行5。
<ol>
<li>简而言之，组织应充分灌注多聚甲醛、戊二醛或福尔马林。可通过标准的经心脏灌注方法实现，该方法通常用于其他器官的取材。在本研究中，实验对象首先通过肌肉注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）进行深度镇静，随后静脉注射过量戊巴比妥钠（25 mg/kg）实施安乐死，并经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS），直至完全放血。接着用PBS配制的4%多聚甲醛溶液灌注约5分钟（约1升）。组织应充分固定于多聚甲醛、戊二醛或福尔马林中。脑组织应按照立体定位仪坐标进行切割修块，从颅骨中取出，称重，测定体积，进行冷冻保护处理，然后冷冻保存5。</li>
</ol>
第2部分：根据Burke等人（2009）的方法对组织进行系统性取样6。
<ol>
<li>在本示例中，我们重点关注了绿猴大脑的额叶。参考空间定义为包含左半球从中央沟至额极的皮层组织。根据我们的研究目的，皮层切片按1/10系列进行取样，切片厚度为50µm。其中一个完整系列用焦油紫染色（系列#1）。系列2被分为两部分，其中一半切片用氯化金染色以显示髓鞘，另一半切片则进行乙酰胆碱酯酶染色（用于界定某些皮层下区域）。其余所有系列切片均以抗原保护液保存，作为我们长期研究计划的一部分。</li>
</ol>
第3部分：体视学（更多细节参见 Mouton 2002）4
<ol>
<li>细胞总数（N）的估算基于以下公式计算： 
N = ssf-1 × asf-1 × tsf-1 × ΣQ-
 其中，ssf 为切片采样分数，asf 为面积采样分数，tsf 为厚度采样分数（即组织实测厚度除以体视学分隔器高度），∑Q- 为在分隔器内计数到的目标对象总数。本方案后续部分将说明如何确定 ssf、asf、tsf 和 ∑Q。 
</li>
<li>切片采样分数（非计算机辅助）<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>必须明确定义从前到后、从背侧到腹侧的整个参考空间。在本示例中，我们关注的是额叶，将其定义为从前端额极尖（前）至中央沟（后）以及外侧沟（腹侧）之间的区域，并排除脑岛。</li>
<li>对于该特定受试者的额叶，共系统性地收集了760个切片，其中76个经焦油紫（cresyl violet）染色。由于目标是在整个参考空间内采集约10个切片，因此对焦油紫染色切片按1/6的比例进行采样，得到切片采样分数约为1/60。我们从最初的6个焦油紫染色切片中随机选择一个作为起始点，之后系统性地每隔6个切片采样一次。该受试者共采样了13个切片（图2）。</li>
</ol></li>
<li>
 面积采样分数（计算机辅助） 
<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>预实验将确定最佳网格大小，即面积采样分数，以在参考空间内采样约100–300个体视学分隔器。在该受试者的额叶中，采用2500 µm2的网格大小，平均产生254个分隔器（图2）。每个分隔器内计数的对象数量应控制在约0–5个之间，本例中为神经元。</li>
</ol> </li>
<li>厚度采样分数（计算机辅助）<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>在每个分隔器位置，测量组织的高度，并对该高度的一部分进行采样，此即厚度采样分数。为确定实测厚度，需沿z轴方向调焦，直至第一个细胞清晰聚焦，然后略微回退至切片顶部，即继续上移至最后一个物体刚好失焦的位置。为确定组织底部，继续沿z轴调焦，直至细胞刚好模糊不清。</li>
<li>在z轴调焦过程中，各深度均应观察到染色细胞；若未观察到，则可能提示染色剂渗透不完全或组织脱水不均，此时应重新染色。此注意事项对于需要免疫探针穿透相对较厚组织切片的免疫染色组织尤为重要。因此，免疫染色组织应使用嗜碱性染料（如焦油紫、苏木精）进行轻度复染，以准确判断切片的顶部和底部，并确认抗体的渗透情况。本研究中，切片在切片机上设定为50 µm厚度。完成全部组织处理后，实测组织厚度平均为17.9 µm（图2），平均收缩率约为65%。需注意，这些结果代表了常规组织学制备处理后组织的典型收缩水平7。</li>
<li>典型研究中分隔器的默认高度为10 µm。分隔器高度与实测切片厚度之间的差值称为“保护高度”（guard height），该部分组织体积内不进行生物学特征的计数。使用保护高度可避免切片表面的组织损伤（如丢失帽状结构）。</li>
</ol></li>
<li>计数对象的总数，ΣQ-<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>为避免因识别错误带来的偏差，必须遵循针对特定生物学特征的标准定义。本例中，我们关注神经元的计数。因此，神经元被定义为具有可见的中央核仁和清晰可辨的细胞质，而胶质细胞通常缺乏可见的核仁和细胞质。该受试者共计数到457个神经元。</li>
</ol></li>
</ol>
第4部分：Stereologer —— 一种计算机化的体视学系统（Stereology Resource Center，马里兰州切斯特）
<ol>
<li>Stereologer 系统会以逐步引导的方式提示用户填写必要的信息。在“研究信息”部分中设定研究参数。由于必须为研究定义一个参考空间，因此应选择体积参数（对于参考空间，应选择 Cavalieri 估计法）。此处也可选择目标对象群体的数加权体积（object volume）以进行估算。在本示例中，仅选择了参考空间的体积。针对每个对象，需选择其数量并定义感兴趣特征，在本例中为神经元（Neurons）。</li>
<li>案例初始化：在此部分设定采样信息。输入切片采样间隔（如果组织被完整地切成多个切块，且每张切片按顺序放置，则此处输入 1）。输入穿过参考空间的总切片数（本例中为 760）。然后输入切片采样间隔（本例中为 59）。系统将自动计算出需要采样的切片数量（本例中为 13）。</li>
<li>探针参数：此部分定义网格和体视学探针（disector）的大小。对于体积测量，使用低倍镜（2.5x–10x）在编辑菜单下设定网格间距。对象观测应在 100x（数值孔径 N.A. 1.3 或 1.4）下进行。框架面积即为体视学探针的大小，本例中使用 50% 屏幕大小。框架高度为体视学探针的厚度，此处设为 10µm。框架间距即为网格的大小。在我们的预实验中发现，采用 2500µm 的间距可在相对较大的参考空间内系统均匀地分布约 150–200 个框架。对于较小区域，应使用更小的网格尺寸。预实验将确定每个具体研究的光学探针参数。</li>
<li>一旦研究参数设定完成，即可开始对组织进行采样。程序将提示您开始采样第一张切片。步骤 1： 程序将在低倍镜下提示用户勾画该切片上的参考空间。系统将根据探针参数在切片上叠加一个网格，随后用户需确认各点是否位于参考空间内。若某点不在参考空间内，只需点击该点，系统将不将其计入体积计算。步骤 2： 系统将根据框架间距参数在参考空间上叠加一个新的网格，用户需验证交点是否落在参考空间内。步骤 3： 系统将提示用户切换至高倍物镜，并移动载物台至第一个体视学探针位置。步骤 4： 此时系统将提示用户定义切片的顶部和底部，随后系统将在 z 轴方向设定采样空间。步骤 5： 用户需点击在 z 平面内位于体视学探针范围内的每一个对象。接触红色边线或体视学探针底部的对象不得计数。每计数完一个对象后，点击“下一个”。载物台将移至下一个体视学探针位置，并重复步骤 4 和 5。当该切片的所有体视学探针均完成计数后，系统将提示用户插入下一张连续切片进行探测。重复步骤 1–5，直至所有连续切片均完成采样。系统将随后提供 asf、ssf、tsf 和 ∑Q 的计算结果。基于这些参数，系统将生成估计的 N 值、参考体积以及估计数量和体积的变异系数（CE）。系统还将给出提高效率或降低 CE 的建议（图 2）。</li>
</ol>
第5部分：代表性结果：
无偏倚体视学可对参考空间内的细胞群体提供高效且可靠的估算。目前已有多种基于计算机的体视学系统，这些系统均依赖于系统性取样和明确定义的参考空间。我们曾使用 BioQuant Life Sciences 系统估算2岁绿猴大脑皮层的总神经元数量超过8.28亿（图3），平均变异系数（CE）为0.042。随后，我们又使用 Stereologer 系统估算发现，额叶约占皮层神经元总数的一半8。
<img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="用于生物学研究的体视学分析工作站，配备显微镜和数据可视化显示器。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 图1 基于计算机的体视学系统。 体视学系统的基本配置相同，包括配备电动载物台（x-y-z方向）、载物台控制器、视频摄像头、计算机和软件的显微镜。最终选择的系统应基于效率、实际需求和成本分析。
<div style="border:1px #000000 solid">
		<table border="0">
			<tbody>
				<tr>
					<td colspan="2">研究信息</td>
				</tr>
				<tr>
 <td>研究名称</td>
 <td>额叶皮层</td>
				</tr>
				<tr>
 <td>主要研究者</td>
 <td>MB</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>物种</td>
 <td>AG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>参考空间 额叶</td>
 <td>皮层</td>
 </tr>
 <tr>
					<td colspan="2">备注</td>
 </tr>
 <tr>
					<td colspan="2">样本信息</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>数据采集者</td>
					<td>MB</td>
 </tr>
 <tr>
					<td>日期</td>
					<td>2008年4月30日，星期三</td>
				</tr>
				<tr>
 <td>组别</td>
 <td>对照组</td>
 </tr>
				<tr>
 <td>受试者</td>
 <td>O26</td>
				</tr>
				<tr>
 <td colspan="2">备注</td>
				</tr>
				<tr>
					<td colspan="2">采样特征</td>
				</tr>
				<tr>
 <td>切片采样间隔</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总切片数</td>
 <td>760</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>切片采样间隔</td>
 <td>59</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>起始切片</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">分数</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ASF</td>
 <td>0.0002</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlabSF</td>
 <td>1.0000</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SSF</td>
 <td>0.0169</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TSF</td>
 <td>0.5587</td>
 </tr>
			</tbody>
	</table>
	<table border="0">
		<tbody>
 <tr>
		<td colspan="6">结果摘要</td>
	</tr>
	<tr>
		<td>参数</td>
 <td>探针</td>
 <td>名称</td>
 <td>结果</td>
 <td>CE</td>
 <td>SD</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>厚度</td>
 <td>---</td>
 <td>---</td>
 <td>17.8996 µ</td>
 <td>---</td>
 <td>---</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>数量</td>
 <td>Disector</td>
 <td>神经元</td>
 <td>243833769.1473</td>
 <td>0.0474</td>
 <td>N/A</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>体积</td>
 <td>Cavalieri Point Grid</td>
 <td>体积</td>
 <td>1719769397954.1284 µ^3</td>
 <td>0.0078</td>
 <td>N/A</td>
	</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0">
	<tbody>
	<tr>
		<td colspan="2">建议</td>
	</tr>
	<tr>
		<td>探针</td>
		<td>对象数量（神经元）</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>CE</td>
 <td>0.0474</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>建议</td>
 <td>CE 可接受。</td>
	</tr>
</tbody>
</table>
<table border="0">
<tbody>
	<tr>
		<td colspan="2">观察的 disector 数量过高，应增加 disector 间距。</td>
	</tr>
	<tr>
		<td>探针</td>
		<td>区域体积（体积）</td>
	</tr>
	<tr>
		<td>CE</td>
		<td>0.0078</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>建议</td>
 <td>CE 可接受。</td>
	</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0">
	<tbody>
	<tr>
		<td colspan="3">切片结果</td>
	</tr>
	<tr>
		<td>切片</td>
 <td>神经元 对象数 神经元 角点数</td>
 <td>体积 区域点数</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>1.	40</td>
 <td>48</td>
 <td>34</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>2.	26</td>
 <td>52</td>
 <td>44</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>3.	29</td>
 <td>56</td>
 <td>48</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4.	39</td>
 <td>100</td>
 <td>83</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>5.	49</td>
 <td>112</td>
 <td>83</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6.	53</td>
 <td>156</td>
 <td>120</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7.	65</td>
 <td>128</td>
 <td>106</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8.	45</td>
 <td>108</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9.	52</td>
 <td>100</td>
 <td>77</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10.	26</td>
 <td>64</td>
 <td>60</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>11.	21</td>
 <td>44</td>
 <td>44</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12.	11</td>
 <td>36</td>
 <td>32</td>
	</tr>
	<tr>
 <td>13.	1</td>
 <td>12</td>
 <td>6</td>
	</tr>
</tbody>
</table>
</div>
使用立体分析系统获得的额叶结果。 对于额叶，立体分析过程中耗时最长的部分是系统采样和切片。每个受试者的拓扑结构、体积和神经元数量估计均在约一天内完成。对左侧半球进行采样，文中将所得数值乘以二，以近似估算双侧半球的总量。
<img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="静态平衡示意图；图示 ΣFx=0 过程及平衡状态下各力的可视化表示。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 3"> 图3 使用BioQuant获得的皮层神经元群体数量估计。 BioQuant系统在进行细胞计数前需要精确的拓扑结构信息。本研究中每例样本平均采集13个切片。每位受试者的皮层拓扑结构构建及后续体积估算耗时15至20小时。拓扑结构构建使用2.5倍物镜完成，细胞计数则采用100倍油浸物镜（数值孔径1.3）进行。在整个左半脑中每隔第100个切片选取一个采样区域，平均每例样本采集约180个体视学采样框（disectors）。完成拓扑结构构建后，神经元计数过程约需一天时间。本研究仅对左半脑进行采样，文中将所得数值乘以2，以估算双侧半脑的总体数量。

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Aat+Rec%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+cut+it%3A+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li>
<li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMouton%2C+PR+%22Principles+and+Practices+of+Unbiased+Stereology%22">Principles and Practices of Unbiased Stereology</a>. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+banking%3A+Making+the+most+of+your+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP%2FPS1%3A+Neuroimaging%2C+Stereology%2C+And+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22AGE%22%5BJournal%5D)">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li>
<li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
</ol>

在灵长类动物脑组织中进行无偏倚体视学研究与在其他生物标本中的操作类似。然而，鉴于灵长类脑组织的体积较大，建议制定周密的处理方案，因为一只绿猴的单侧大脑半球在50 µm厚度切片时可产生超过1200个切片。我们首先建议使用立体定位法将脑组织切割为1 cm大小的组织块，这可确保各组织块之间以及不同个体之间的切面标准化，减少组织块之间的部分切片，并使组织块尺寸更易于处理5。体视学研究中的一个关键步骤是系统性取样，即在整个参考区域中均匀获取6–10个切片。对于灵长类脑组织而言，这种取样方式会留下大量未处理的组织材料，因此为了最大化每例脑组织所能获取的研究数据，我们建议将组织保存在抗原保护液中，以备长期研究使用6。当组织被存档保存后，可针对猴脑中的目标蛋白设计系统性的免疫检测方案，用于后续体视学分析9。对于较大的脑区，如大脑皮层或脑叶，可能需要10–14个切片，因此在切片前应预先规划，确保对任何感兴趣的最小参考空间至少获取10个切片。此外，还应在对照个体上开展预实验，以确定体视学研究的各项参数。在展示或解读已发表的体视学数据时，应同时报告asf、tsf</e...

<table><tbody><tr><td>体视学分析软件 Stereologer</td><td>体视学资源中心（马里兰州切斯特）</td><td>www.disector.com</td><td></td></tr><tr><td>Stereology Tool-Kit Stereologer 系统</td><td>BioQuant生命科学公司（田纳西州纳什维尔）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

了解何为关键：非人灵长类动物大脑中的无偏立体学

Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

非人灵长类动物是理解人类大脑正常功能及疾病过程的重要转化研究物种。体视学无偏采样法是目前公认的组织切片中生物结构定量分析的金标准方法。2，可为哺乳动物大脑中的生物学特征生成可靠的结构数据3. 该方法的关键要素包括对解剖学定义的结构（参考空间）进行无偏倚（系统-随机）采样，并对参考空间内生物物体的细胞数量与大小、纤维和毛细血管长度、表面积、区域体积及其空间分布进行定量分析4. 与以往方法相比，这些体视学方法的优势在于避免了因错误假设和无法验证的模型所导致的所有已知系统性（非随机）误差来源。本研究记录了计算机化体视学在生物学中的一项应用，用于估算非洲绿猴脑额叶皮层中的神经元总数（Chlorocebus aethiops sabeus)，并在两个商用体视学软件 BioQuant Life Sciences 和 Stereologer 的辅助下完成（图1）。除了对 BioQuant 和 Stereologer 所得结果进行对比分析外，Stereologer系统，本研究提供了一个详细的方案Stereologersystem

灵长类动物大脑的解剖结构可为人类正常及病理状态提供重要见解。无偏倚体视学是一种能够准确、高效地估算特定参考空间内神经元总数（或其他细胞类型）的方法1。

非人灵长类动物是理解人类大脑正常功能及疾病过程的重要转化研究物种。无偏倚……

该操作步骤首先定义参考空间。立体定位图谱有助于确定目标区域的边界。接下来，整理切片并确定切片采样频率。将待采样的第一部分插入显微镜，并填写采样参数。在 theologist 系统中，将在参考空间上覆盖一个网格，并在每个交点处采集一个光学分离器。当每个切片上的所有光学分离器均完成采样后，体视系统将提供该研究的结果。大家好，我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室的 Dr. Mark Burke。大家好，我是 Dr. Shaheen Zur，同样来自蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室。大家好，我是蒙特利尔大学视光学学院视觉神经科学实验室主任 Dr. Morris Petto。今天我们将向您展示一种在非人灵长类动物中进行无偏倚放射学分析的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法来估算大脑不同区域的神经元总数。现在让我们开始吧。开始本方案时，应使用先前已灌注过的脑组织。使用如多聚甲醛等固定剂进行固定后，脑组织应在立体定位空间中进行切块，经冷冻保护并冻结。如需详细了解这些方案，请参阅我们近期发表的 JoVE 文章《非人灵长类动物脑组织的解剖》。在立体定位空间中，应系统地切取脑组织，以包含所有参考空间。如需详细了解本方案，请参阅我们近期发表的 JoVE 文章《脑库建设：充分利用您的科研样本》。在本实验中，我们使用绿猴脑的额叶。该系列取大脑皮层10个部分中的1个，并以50微米厚度进行切片。为计算估计的细胞数量N，我们使用以下公式，其中SSF为切片采样比例，ASF为面积采样比例。TSF 是厚度采样分数，即所测得的组织厚度除以分割器高度，而“立方体”是指在分割器内计数的目标对象总数。为了确定切片采样分数，必须明确定义从前到后以及从背侧到腹侧的整个参考空间。本研究关注的是额叶，我们将额叶定义为从额极尖端到中央沟和外侧沟的区域。除该受试者的额叶岛部外，系统地收集了共计760个切片，其中76个用紫晶染料染色。由于在参考空间内目标为10个切片，因此每六个紫晶染色切片中选取一个进行采样。这使得切片采样分数（SSF）约为六十分之一。我们随机选取前段冠状紫染切片中的一片作为起始，随后系统性地采集其余每六分之一的切片。之后，针对选定的样本共采集13个切片。为避免因识别错误带来的偏差，必须遵循特定生物学特征的标准化定义。本研究中，我们旨在对神经元进行计数，并将神经元定义为具有可见的、位于中央的细胞核以及界限清晰的细胞质的细胞。在本研究中，我们使用了立体定位系统（stereo），这是一种计算机化的神经解剖学系统。该系统会以逐步提示的方式引导用户填写所需信息。在研究信息部分，需设定研究的各项参数。应选择体积参数以定义研究的参考空间。此外，也可在此处选择对象体积，以估算感兴趣对象群体的数目加权体积。本案例中，仅选择参考空间的体积。针对每个物体，选择数量并定义感兴趣的特征，此处为神经元。为建立

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

知道重要的：无偏体视学在非人类灵长类动物的脑

非人灵长类动物是我们理解大脑正常功能的重要转化研究物种。灵长类动物大脑的解剖结构可为人类正常及病理状态提供重要的研究依据。...

在立体定位空间中解剖非人灵长类动物大脑

脑库建设及生物样本的系统性取样为无偏倚的体视学分析奠定了基础，并最大限度地提高了从每个标本中获取的数据量。...

脑库建设：充分利用您的科研样本

来源：Olesen, M. V.,et al．采用光学分数法估算电休克疗法大鼠模型中的细胞数量．J. Vis. Exp.（2017）．...

使用光学分馏器技术定量大鼠脑组织中新生成的神经元

系统化的脑组织切片程序对于将特定的神经精神现象与明确的神经病理学诊断相关联至关重要。根据不同的临床与学术需求，脑组织切片方法存在多种差异。本方案描述了一种对称的双半球脑切片程序，旨在研究人类脑病理学中的半球差异，并最大限度地利用当前及未来的生物分子/神经影像技术。...

对称双半球尸检脑组织切取技术用于研究人类健康与病理脑状态

本方案描述了通过表达荧光标记物的改良型狂犬病毒进行逆向感染标记后，对特定神经元群体进行的大规模重构，以及独立且无偏倚的聚类分析，从而实现对不同神经元亚类之间形态学参数的全面表征。...

基于形态学指标的大规模重建及无偏独立聚类以分类特定神经元群体

本文介绍了一种体视学方法——光学分馏器法，用于定量分析电休克刺激后大鼠海马中新生神经元的形成及其存活情况。当正确实施时，体视学方法的高灵敏度和高效率可确保以固定且预先设定的精度获得准确的估算结果。...

使用光学分数法估算电休克治疗大鼠模型中的细胞数量

本研究提供了一种利用标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行无偏立体学估算的逐步操作方案即，...

使用光学分数法和标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行体视学估算

以下方法旨在提供一种综合性方案，用于制备非人灵长类动物（NHP）神经外科手术，该方案采用了一种新颖的三维（3D）打印技术与磁共振成像（MRI）数据提取相结合的方法。...

基于MRI的非人灵长类神经外科手术规划工具箱

本方案描述了使用iDISCO+对完整小鼠脑组织进行磁共振成像、透明化处理和免疫标记的方法，随后详细介绍了利用光片显微镜进行成像，以及使用NuMorph进行后续分析的步骤。...

利用MRI、组织透明化和光片显微镜对完整新生小鼠脑进行全脑单细胞成像与分析

序列双光子断层成像（STPT）是一种结合双光子成像、自动载物台控制和切片机切片技术，用于以三维形态对大体积组织进行成像的技术。本文介绍了一种应用于狨猴脑组织的STPT实施方案，旨在更深入地理解其结构特征。...

用于神经解剖学分析的整个狨猴脑串行双光子断层成像

现代神经科学需要探索多种物种之间的差异，包括实验啮齿类动物和人类。然而，在涉及大脑较大的哺乳动物时，技术难题随之而来。该方法针对差异较大的哺乳动物中神经元群体的种间变异进行研究，获得可比较的结果，进而绘制出揭示进化模式的图谱。...

一种用于广泛不同哺乳动物大脑中定量细胞计数研究的比较方法

学习无偏体视学方法，利用光学分切器精确估算非人灵长类动物特定脑区的神经元数量。该技术结合立体定位图谱与显微镜系统，为神经解剖学和脑疾病研究提供可靠的细胞计数数据。

了解何为关键：非人灵长类动物大脑中的无偏立体学

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