Name: 小鼠乳腺上皮细胞形成过程中Lactogenic分化的微球体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: 学习使用HC11小鼠乳腺上皮细胞诱导乳源性分化并形成微球体的实验方法。该方案通过地塞米松、胰岛素和催乳素处理，利用相差显微镜观察和计数微球体，为研究乳腺细胞分化调控提供可靠的体外模型。

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本研究工作得到了国会指定医学研究基金拨款（DAMD17-01-0264）和美国军事癌症研究所对 M.L. Cutler 的资助。

<ol>
<li>HC11 细胞在添加了 10% 胎牛血清、5 μg/ml 胰岛素、10 mM HEPES 和 10 ng/ml 表皮生长因子（EGF）的 RPMI 1640 培养基中培养 6 天至汇合，以建立分化能力。</li>
<li>细胞用 PBS 洗涤，并在不含 EGF 的生长培养基中维持 24 小时。</li>
<li>为诱导泌乳分化，将细胞在分化培养基中孵育，即含有地塞米松（10-6 M）、胰岛素（5 μg/ml）和催乳素（5 μg/ml）的 RPMI 培养基，简称 DIP。</li>
<li>在添加 DIP 后的指定时间点，使用配备数码相机的 Olympus IX71 显微镜通过相差显微镜观察并拍摄、计数乳腺球。</li>
</ol>
代表性结果：
图1分别展示了正常乳腺上皮细胞单层培养的低倍镜图像、多个乳腺球的图像，以及单个乳腺球的高倍镜图像。 <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="乳腺球形成，显微镜图像；正常单层细胞与多个球体，高倍放大。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图1. 乳腺球。 （a）正常乳腺上皮细胞单层应呈现为融合的扁平细胞层。（b）DIP刺激3-5天后出现多个乳腺球。照片拍摄于添加DIP后第5天。（c）添加DIP后第5天，含乳腺球的单个视野的高倍镜图像。

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

为了使该技术成功并达到最佳质量，上皮细胞在用泌乳激素诱导前必须维持在汇合状态。有时可能会出现大量乳腺球，使得定量变得困难。因此，为了定量目的，最好在乳腺球数量能够被计数的时间点对其进行拍照。
尽管已有多种分子标志物用于评估乳腺上皮细胞泌乳分化的程度，但对于在二维培养条件下生长的细胞，可用的形态学标志物却很少。上皮细胞单层在培养中能够形成微小的穹顶样结构，使乳蛋白得以聚集，这一特性为观察该发育过程中发生的形态学变化提供了一种有效途径。

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（PenStrep）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠乳腺上皮细胞在泌乳分化过程中形成乳腺球

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

一种常用于评估小鼠乳腺上皮细胞培养中泌乳分化程度的表型指标是形成被称为乳腺球体的穹顶状细胞结构1. HC11 细胞系已被用作研究乳腺泌乳分化调控的模型系统in vitro和体内2HC11细胞在泌乳激素处理下会分化并合成乳蛋白。当HC11小鼠乳腺上皮细胞生长至融合状态后，通过添加包括地塞米松、胰岛素和催乳素在内的泌乳激素组合（简称DIP）诱导其发生泌乳分化。在诱导分化后的不同时间点（最长至120小时）对分化中的HC11细胞进行拍照，并统计每份培养物中出现的乳腺球（mammosphere）数量。单个乳腺球的大小与分化程度相关，这一点在分化细胞的图像中有所体现。

HC11细胞的泌乳分化可通过形成称为乳腺球的穹顶状结构来表征。可通过相差显微镜对这些结构进行计数，以辅助量化泌乳分化程度。

一种常用于评估小鼠乳腺上皮细胞培养物泌乳分化程度的表型指标是……的形成

大家好，我是来自健康科学统一服务大学病理学系Mary Lou Cutler博士实验室的Bethany Morrison。今天我们将向您展示一种从HC 11小鼠乳腺上皮细胞培养乳腺球（mammospheres）的实验方法。我们实验室利用该方法研究泌乳分化过程。那么，让我们开始本实验方案。将HC 11细胞在RPMI 1640培养基中培养六天至汇合，培养基中添加10%胎牛血清、5微克/毫升胰岛素、10微摩尔Heiss和10纳克/毫升表皮生长因子（EGF），以建立细胞的分化能力。这些细胞已被南希·海因斯（Nancy Hines）和伯纳德·格罗纳（Bernard Groner）的实验室广泛用于在组织培养操作台中研究基因分化的调控。随后，细胞用 PBS 洗涤，并在不含 EGF 的生长培养基中培养 24 小时。经过该孵育后，细胞被转入分化培养基中孵育，分化培养基由添加了地塞米松、胰岛素和催乳素的 RPMI 组成，以在孵育后诱导乳源性分化。在分化培养基中，使用配备数码相机的奥林巴斯IX 71显微镜对乳腺球进行拍照和计数。通过相差显微镜，在诱导后的120小时内多次对乳腺球进行拍照和计数。该图像显示了正常记忆的低倍放大图像。上皮细胞单层需在使用促基因激素刺激前维持汇合状态约三天。以下是诱导后三天在低倍放大下观察到的新形成乳腺球体。它们开始呈现为散布于上皮细胞中、随机分布的小圆顶样结构。再次在低倍镜下观察。此处显示的是诱导后第五天形成的多个乳腺球。在高倍镜下，可见乳腺球在大小和数量上均持续增加，乳腺球的泡状或圆顶样特征清晰可见。我们刚刚向您展示了如何诱导记忆性上皮细胞，使其形成乳腺球体，后者可作为生精分化的标志物。进行此操作时，重要的是要记住在诱导前维持细胞的汇合度，因为在此期间，细胞会产生基质蛋白，需要通过与这些蛋白相互作用才能充分激活，从而响应生精激素。同样重要的是，务必在处理前从培养基中去除表皮生长因子（EGF），因为EGF会抑制分化过程。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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小鼠乳腺上皮细胞形成过程中Lactogenic分化的微球体

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小鼠乳腺上皮细胞在泌乳分化过程中形成乳腺球

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