Name: 标准化的制备小鼠肺组织单细胞悬浮液使用gentleMACS Dissociator (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学习使用gentleMACS解离器制备小鼠肺组织单细胞悬浮液的标准化方法。该方案利用胶原酶D和DNase处理组织，通过70微米细胞筛网过滤，获得高活性、可培养的细胞，适用于白细胞和内皮细胞等下游研究应用。

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作者为德国 Miltenyi Biotec GmbH 公司的员工。

为了在无菌条件下操作，建议在层流罩内完成所有步骤。
1. 材料
<ol>
<li>HEPES 缓冲液：10 mM HEPES-NaOH，pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgCl2，1.8 mM CaCl2</li>
<li>胶原酶 D 溶液：胶原酶 D：100 mg/mL（胶原酶 D &gt; 0.15 U/mg），溶于 HEPES 缓冲液</li>
<li>DNase I 溶液：20,000 U/mL DNase I</li>
<li>PBS 缓冲液，pH 7.2</li>
<li>PEB 缓冲液：1 份 BSA 储存液加入 20 份 autoMACS 洗涤液中</li>
<li>组织：来自 6 至 7 周龄成年雌性 BALB/C 小鼠的肺组织，不含邻近器官</li>
<li>可选：CD11c 微珠、MACS MS 柱、MACS 分离器，用于从小鼠肺单细胞悬液中分离树突状细胞</li>
</ol>
2. 解离肺组织
<ol>
<li>用含有 PBS 的培养皿冲洗组织，以去除红细胞。</li>
<li>将最多 450 mg 的肺组织转移至含有 4.9 mL HEPES 缓冲液的 gentleMACS C 管中。</li>
<li>加入 100 μL Collagenase D 溶液，使 Collagenase D 的终浓度为 2 mg/mL。</li>
<li>对于不超过 150 mg 的组织，加入 10 μL DNase I 溶液（DNase I 终浓度为 40 U/mL）；对于 150–450 mg 肺组织，加入 20 μL DNase I 溶液（DNase I 终浓度为 80 U/mL）。</li>
<li> tightly 封闭 C 管并将其安装到 gentleMACS 组织解离仪上，然后运行程序 "m_lung_01"。</li>
<li>在 37°C 下孵育 30 分钟，期间使用自动旋转或每 5 分钟手动翻转一次。</li>
<li>将样品重新放回 gentleMACS 组织解离仪，并运行程序 "m_lung_02"。</li>
</ol>
3. 过滤
<ol>
<li>通过将50 mL离心管的管盖替换为70 μm孔径的细胞滤网，准备用于收集过滤后细胞的离心管。</li>
<li>当第二个gentleMACS程序结束后，根据管内样品的分布情况，可短暂离心以使样品沉降至管底。</li>
<li>使用合适的1000 μl移液器吸头，通过C管的隔膜密封盖吸取细胞，并将其转移至细胞滤网上。</li>
<li>用5 ml室温HEPES缓冲液冲洗细胞滤网。</li>
<li>将细胞在50 mL离心管中以300×g离心10分钟，形成细胞沉淀。</li>
<li>吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于所需体积的PEB缓冲液中。</li>
</ol>
第4部分：代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig1.jpg" alt="流式细胞术散点图，FL-2 对 FL-3，PI 标记，92% 细胞群分析。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 1"> 图 1. 使用 gentleMACS™ 解离仪进行肺组织解离后，获得 92% 的活细胞。死细胞经碘化丙啶（PI）荧光染色（右侧散点图；左侧散点图：无 PI 染色）。
<img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig2.jpg" alt="流式细胞术点图，CD45-PE 对 CD146-FITC 和 CD31-FITC，细胞群体分析。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 2"> 图 2. 使用 gentleMACS 组织解离器解离小鼠肺组织，可获得高比例的活白细胞和内皮细胞。所得单细胞悬液用 CD45-PE 和 CD146-FITC 或 CD31-FITC 染色，并通过流式细胞术进行分析。
<img src="/files/ftp_upload/1266/1266figure2c.png" alt="流式细胞术点图，Anti-mPDCA-1 对 CD11c，免疫表型分析，细胞群体分析。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 3"> 图 3. 从小鼠肺组织获得的单细胞悬液用 CD11c-FITC 和 Anti-mPDCA-1-APC 进行染色，以检测小鼠 CD11clow m-PDCA-1+ 浆细胞样树突状细胞以及 CD11chigh 细胞。
 <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig4.jpg" alt="流式细胞术分析；富集前后CD11c-PE与抗MHC II类分子-FITC的散点图。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure 4"> 图4. 使用CD11c磁珠、MiniMACS分离器和两根MS柱富集树突状细胞。

<ol><li>Swanson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3-Ligand%2C+IL-4%2C+GM-CSF%2C+and+Adherence-Mediated+Isolation+of+Murine+Lung+Dendritic+Cells%3A+Assessment+of+Isolation+Technique+on+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function.</a> J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).</li>
<li>Vermaelen, K., Pauwels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+simple+discrimination+of+mouse+pulmonary+dendritic+cell+and+macrophage+populations+by+flow+cytometry%3A+Methodology+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights.</a> Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).</li>
</ol>

作者为 Miltenyi Biotec GmbH 的员工，该公司生产本文所用仪器。

在本视频中，我们介绍了一种新的小鼠肺组织解离方法。我们证明，通过机械和酶解联合处理肺组织，可获得较高比例的活白细胞和内皮细胞。具体而言，组织的机械解离由 gentleMACS 解离器完成。gentleMACS C 管包含一个转子-定子系统，能够以温和的方式解离组织。该过程由仪器的程序设置控制，相关参数已优化，以实现细胞得率和活力的最大化。所获得的单细胞悬液使用 CD45-PE 和 CD146-FITC 或 CD31-FITC 进行染色，并通过流式细胞术检测白细胞和内皮细胞。单细胞悬液中的树突状细胞使用 CD11c-FITC 和 Anti-mPDCA-1-APC 进行染色。此外，利用 MACS 技术从小鼠肺单细胞悬液中富集树突状细胞：使用 CD11c 微珠对树突状细胞进行磁性标记，并通过 MiniMACS 分离器和 MS 柱进行分离1,2。总体而言，我们将新的解离方案与磁性细胞分选技术相结合，建立了一种从肺组织中获取特定细胞类型的标准化方法。

<table><tbody><tr><td>C管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; 起始试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; 试管旋转仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS&amp;#8482; 冲洗液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>磁珠激活细胞分选&amp;#174; BSA 储存液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-052-001</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c-FITC，CD11c-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-092-026130-091-830</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-mPDCA-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-091-963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD146-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-092-026</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-091-610</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>碘化丙啶溶液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Art 1000 加长型移液器吸头</td><td>分子生物产品</td><td>货号 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

使用 gentlemacs 解离仪制备小鼠肺组织单细胞悬液的标准方案

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

从组织制备单细胞悬液是细胞研究中许多实验的重要前提。解离完整器官的过程需要特定的参数，以可重复的方式获得大量活细胞。gentleMACS解离仪通过简单且实用的方案优化了这一操作。该仪器包含预设程序，专为高效而温和地解离多种组织类型（包括小鼠肺组织）而优化。本文展示了gentleMACS解离仪在小鼠肺组织处理中的应用。

关键词：单细胞悬液，组织解离，细胞研究，gentleMACS解离仪，小鼠肺组织，活细胞

从特定组织类型中解离细胞需要优化组织震荡参数，以获得大量具有活性且可培养的细胞。Miltenyi gentleMACS 组织解离器通过一种简单且实用的方案优化了这一操作。本文介绍了该设备在肺组织处理中的应用。

使用 gentleMACS 解离仪制备小鼠肺组织单细胞悬液的标准方案

从组织制备单细胞悬液是细胞研究中许多实验的重要前提。该过程的……

在本视频方案中，您将看到如何使用 Gentle Max 对成年小鼠肺组织进行解离。在胶原酶 D 和 DNase I 存在下，将肺组织解离为单细胞悬液后，通过 70 微米细胞滤网过滤，离心并重悬，用于后续实验。您好，我是来自德国 Miltenyi Biotec 的 Melanie Mlu。今天，我将向您展示一种利用GenX解离技术从小鼠肺组织制备单细胞悬液的可重复且自动化的操作流程。我们实验室使用该方法制备单细胞悬液，用于后续分离白细胞或内皮细胞。好了，让我们开始吧。在开始实验方案之前，需要准备并备好几种标准溶液。首先，我们需要赫贝斯缓冲液。其次，需要含有100毫克/毫升酶和赫贝斯缓冲液的胶原酶D溶液。第三，一种含有每毫升20,000单位的dase one溶液。最后，两种常用的缓冲溶液：pH为7.2的典型PBS缓冲液，以及由AutoMax冲洗液和BSA储备液配制而成的PEB缓冲液。我们从一只六至七周龄的雌性活检小鼠中获取已解剖的肺组织，开始本实验方案。确保肺组织不带有邻近器官，如心脏和胸腺、进出肺的血管、气管以及结缔组织。将组织置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中冲洗，以去除红细胞。通常，此年龄段小鼠的肺组织重量在110至150毫克之间。如果计划处理来自较年长动物或其他小鼠品系的肺组织，请称量组织和缓冲液体积。每管最多可处理450毫克组织。将肺组织转移至已装有4.9毫升heis缓冲液的gentle max C管中。向肺组织和缓冲液中加入100微升胶原酶D溶液，使其终浓度达到每毫升2毫克。现在加入10微升dase。每份超过150毫克的组织使用一种溶液。加入20微升的酶一溶液。确保C管紧密闭合，并将其倒置放在gentle max解离仪上。确保组织位于转子和定子之间。选择肺组织程序，按下启动按钮开始运行，程序结束后取出C管，将样品孵育30分钟。在37摄氏度培养箱中孵育期间，应使用最大混合管旋转仪旋转试管，或每5分钟手动翻转一次。孵育结束后，将C管放回轻柔最大解离仪中，运行第二个肺程序。程序运行期间，通过将50毫升试管的管盖替换为70微米孔径的细胞滤网，准备用于收集过滤后细胞的容器。当解离程序结束后，根据试管内样本物质的分布情况，可能需要短暂离心以浓缩样本物质。可通过移液器穿过C管密封隔膜盖将解离的细胞从管中移出。使用合适的1000微升移液器吸头，将细胞悬液加入细胞筛中，以去除较大的颗粒或聚集体。待溶液流尽后，通过向细胞筛中再加入5毫升室温HEES缓冲液，洗涤细胞筛，使过滤后的细胞沉淀。将50毫升离心管在300 ×g 条件下离心10分钟。弃去上清液，用所需体积的室温PEB缓冲液重悬细胞沉淀。不要倾倒上清液。现在可以进行后续应用。使用本方案解离小鼠肺组织可获得高比例的活白细胞和内皮细胞。将获得的单细胞悬液用CD45 PE以及CD146 FITC或CD31 FITC进行染色，并通过流式细胞术进行分析。该图显示了使用CD11c磁珠、一个minimax分离器和两个MS柱对树突状细胞进行富集的结果。好了，我刚刚向您展示了如何通过使用gentleMACS解离仪和C管，以标准化的方法从小鼠肺组织中制备单细胞悬液。该方法可实现高效且温和的组织解离。进行此操作时，重要的是要正确解剖肺组织，并在解剖后立即处理组织。制备得到的单细胞悬液可用于后续实验。例如，对细胞进行磁性标记，然后分离白细胞或内皮细胞。好了，就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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