Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

在本视频实验步骤中，您将看到如何在肺组织解离后使用 Gentle Max 解离成年小鼠肺组织。在胶原酶 d 和 DNAS 存在下，使用 70 微米细胞过滤器离心机过滤单细胞悬液，并悬浮以用于进一步应用。大家好，我是来自德国 Mil Biotech 的 Melanie Mlu。

今天，我将向您展示一种可重现的自动化程序，用于使用 GenX 解离从小鼠肺组织中制备单细胞悬液。我们在实验室中使用此程序制备用于制备白细胞或内皮细胞的单细胞悬液。好了，让我们开始吧。

在我们开始实验步骤之前，必须准备一些标准溶液并准备就绪。首先，我们需要 Hebes 缓冲区。第二种是胶原酶 D 溶液，每毫升含有 100 毫克酶和 hebes 缓冲液。

第三种，每毫升含有 20， 000 单位的 dase one 溶液。最后，两种常见的缓冲解决方案。pH 值为 7.2 的典型 PBS 缓冲液和源自 AutoMax 冲洗液和 BSA 储备液的 PEB 缓冲液。

我们从 6 至 7 周龄雌性活检小鼠的解剖肺开始我们的方案。确保肺中没有相邻器官，如心脏和胸腺、传出和传入血管、气管和结缔组织。在含有 PBS 的培养皿中冲洗组织以去除红细胞。

通常，这个年龄的小鼠肺重在 110 到 150 毫克之间。如果您计划将老年动物或其他小鼠品系的肺关联起来，请称量组织和缓冲液。每根管子最多可以解离 450 毫克组织。

将肺组织转移到装有 4.9 毫升 heis 缓冲液的温和的 max C 管中。向肺组织和缓冲液中加入 100 微升胶原酶 D 溶液，最终浓度为 2 毫克/毫升。现在是 10 微升 dase。

一种溶液适用于超过 150 毫克的组织。加入 20 μL dase one 溶液。确保 C 管紧闭，并将其倒置放在温和的 max dis 上。

确保组织位于转子和定子之间。选择 lung 程序，并在程序结束时按启动按钮运行它。从仪器中取出 C 管，将样品孵育 30 分钟。

在 37 摄氏度的培养箱中，在孵育过程中，应使用最大混合管旋转器旋转管或每 5 分钟手动转动一次试管。孵育后，将 C 管放回 gentle max Associator 并运行第二个肺程序 在程序运行时，准备一个 50 毫升的试管，用 70 微米网状细胞过滤器替换盖子，用于收集过滤的细胞。解离程序结束后，根据样品材料在试管中的分布，您可能需要短暂离心试管以浓缩样品材料。

移液穿过 C 管的隔膜密封盖，可以从试管中取出解离的细胞。使用合适的 1000 μL 移液器吸头，将细胞悬液涂在细胞过滤器上，以去除较大的颗粒或聚集体。溶液排干后，再加入 5 毫升室温和 hees 缓冲液来洗涤细胞过滤器，以沉淀过滤后的细胞。

将 50 毫升试管以 300 GS 离心 10 分钟。现在吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于所需体积的室温中。PEB 缓冲液。

不要倒出上清液。您现在可以继续进行下游应用程序。使用该程序解离小鼠肺组织将产生高百分比的活白细胞和内皮细胞。

用 CD 45 PE 作为 CD 1 46 FITC 或 CD 31 FITC 对衍生的单细胞悬液进行染色，并通过流式细胞术分析。该图显示了使用 CD 11 C 微珠、一个 minimax 分离器和两个 MS 色谱柱对树突状细胞的富集。好。我刚刚向您展示了如何使用温和的混合解离管和 C 管以标准化方式从小鼠肺组织中制备单细胞悬液。

这种方法允许高效和生成组织解离。进行此程序时，正确解剖肺并在解剖后立即处理组织非常重要。制备的单细胞悬液可用于进一步的实验。

例如，细胞的磁性标记，然后是白细胞或内皮细胞的分离。好了，就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。