Name: 创建小鼠实验与弹性蛋白酶的腹主动脉瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-23T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习利用猪胰弹性蛋白酶在小鼠体内诱导腹主动脉瘤的手术方法。该模型通过结扎主动脉分支并灌注弹性蛋白酶，可在14天内形成稳定的动脉瘤，为研究血管生物学和开发治疗策略提供可靠的动物实验平台。

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本工作由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助，项目为SCCOR基金“AAA疾病：机制、分层与治疗”（P50 HL083800-03）

<ol>
<li>使用吸入式异氟烷（2.0–3.0 mL/L）对小鼠进行麻醉。</li>
<li>剃除腹部毛发，并用酒精和碘伏擦拭消毒。</li>
<li>将小鼠仰卧位放置于手术区域。</li>
<li>术者佩戴无菌手套，所用器械均已通过热珠灭菌器灭菌。</li>
<li>沿腹中线做一长切口。使用无菌纱布将腹腔内容物向外牵拉，以暴露腹主动脉。</li>
<li>从左肾静脉水平至分叉处游离腹主动脉。</li>
<li>暴露腹主动脉的分支，并使用10-0缝线结扎。距离分叉处1.0 cm范围内的所有主动脉分支均需结扎。</li>
<li>在主动脉近端和远端分别放置临时的6-0丝线结扎线。</li>
<li>使用30号针头在分叉处切开腹主动脉（主动脉切开术）。</li>
<li>将经热拉制成锥形的聚乙烯导管（PE-10）经切口插入主动脉，并用结扎线固定。</li>
<li>通过悬挂于136 cm高度的生理盐水袋校准压力至100 mmHg，将含有1型猪胰弹性蛋白酶（4.5 U/mL）的生理盐水灌注入主动脉。在持续5–15分钟的弹性蛋白酶灌注过程中，主动脉通常扩张至原始直径的150–170%。</li>
<li>随后移除灌注导管，并使用10-0缝线缝合主动脉切口，以避免狭窄。</li>
<li>缝合主动脉切口后，松开远端结扎线。</li>
<li>若修复后的主动脉切口无明显或仅有少量出血，则松开近端结扎线。扩张后的主动脉立即充盈血液。</li>
<li>将肠管还纳至腹腔，伤口使用6-0尼龙/聚丙烯缝线分两层缝合关闭。</li>
<li>在伤口处滴加0.25%布比卡因（每厘米切口长度约一滴），并皮下注射一剂卡洛芬（5 mg/kg）。</li>
<li>将小鼠置于温暖区域，通常在15分钟内恢复清醒。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1280/fig1280.png" alt="弹性蛋白酶诱导的腹主动脉瘤进展；手术图像显示的实验阶段；动脉瘤发展过程。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">     图1.弹性蛋白酶诱导腹主动脉瘤的代表性结果。

<ol><li>Anidjar, S., Salzmann, J. L., Gentric, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-973 (1990).</li>
<li>Pyo, R., Lee, J. K., Shipley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+of+matrix+metalloproteinase-9+%28gelatinase+B%29+suppresses+development+of+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms.</a> J Clin Invest. 105 (11), 1641-1641 (2000).</li>
<li>Carsten, C. G. 3rd, Calton, W. C., Johanning, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase+is+not+sufficient+to+induce+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms.</a> J Vasc Surg. 33 (6), 1255-1255 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

既往研究发现，不同商业化的弹性蛋白酶制剂在诱导腹主动脉瘤（AAA）形成方面存在显著的批间差异3。因此，必须对生产批次进行监控，并设置适当的对照组，以记录该制剂诱导AAA形成的能力。
有趣的是，该模型中腹主动脉瘤（AAA）形成易感性取决于所使用的小鼠品系3。本视频中使用的小鼠为 C57Bl/6 品系，采用所述方案可稳定诱导 AAA 形成。可根据其他品系的情况调整弹性蛋白酶浓度和/或孵育时间。
尽管在小鼠中利用弹性蛋白酶构建腹主动脉瘤（AAA）的技术具有较高的操作难度，但该技术对于研究AAA形成与发展的潜在分子机制至关重要。通过实践和技术改进，我们实验室已将成功率提高至90%以上。我们相信，本视频及配套文字将有助于降低希望采用该技术的实验室的学习曲线。
故障排除
<ol>
<li>应用10-0缝线结扎腹主动脉的分支，以防止术中出血以及因渗漏导致弹性蛋白酶灌注时扩张不全。</li>
<li>保持术野清晰和充分暴露非常重要，...

<table><tbody><tr><td>Ⅰ型猪胰弹性蛋白酶</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1250</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管（PE-10）</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>CHANGE-A-TIP</td><td></td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>18010-00 (FST)</td><td>电凝刀</td></tr><tr><td>LEICA MZ6</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>LEICA DFC290HD</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>USB相机</td></tr><tr><td>Image Pro Express ver. 6.0</td><td></td><td>Media Cybernetics Inc.</td><td></td><td>软件</td></tr></tbody></table>

利用弹性蛋白酶建立小鼠实验性腹主动脉瘤模型

Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase 

自 Anidjar 及其同事首次在大鼠中描述以来，通过将猪胰弹性蛋白酶短暂灌注至肾下腹主动脉管腔内，已成为最广泛应用的腹主动脉瘤（AAA）动物模型。1 该模型的建立依据在于 AAA 中弹性蛋白结构的破坏。此大鼠模型已被改良，可用于在小鼠的肾下主动脉区域诱导 AAA。2 由于大量转基因和基因敲除小鼠的出现，该模型能够为 AAA 的病理生物学机制提供广泛深入的见解。此外，它也是一种可行的平台，可用于测试针对 AAA 的潜在治疗药物。在本视频中，我们展示了本实验室所采用的弹性蛋白酶灌注诱导 AAA 的操作流程。 
使用2.5%异氟烷对小鼠进行麻醉，并在无菌条件下进行剖腹手术。借助体视显微镜（Leica）分离腹主动脉。在近端和远端主动脉周围放置临时结扎线后，用30号针头尖端在主动脉分叉处做主动脉切口。将一段经热拉锥处理的PE-10聚乙烯导管经切口插入并固定。随后在100 mm Hg压力下，用含有I型猪胰弹性蛋白酶（4.5 U/mL；Sigma Chemical Co.）的生理盐水对主动脉腔进行灌注，持续5–15分钟。移除灌注导管后，修复主动脉切口，且不造成管腔狭窄。

本视频展示了如何通过将猪胰弹性蛋白酶短暂灌注至小鼠腹主动脉肾下段管腔内，从而在小鼠体内诱导腹主动脉瘤（AAA）。由于存在大量转基因和基因敲除小鼠，该模型能够为AAA的病理生物学机制提供广泛深入的见解。

将猪胰弹性蛋白酶短暂经腔内灌注至腹主动脉肾下段是目前最常用的动物模型之一，用于……

用于建立腹主动脉瘤的外科手术首先进行腹部正中切口。将腹腔内容物移开后，结扎所有主动脉分支，并结扎主动脉的近端和远端部分。用针刺穿心脏，并通过一根经热处理拉细的聚乙烯管输送大量弹性蛋白酶。灌注完成后，关闭主动脉离断处。移除结扎线，主动脉充满血液，然后关闭腹腔。随后让小鼠恢复，动脉瘤将在14天内完全扩张。大家好，我是来自斯坦福大学心血管医学系胎儿细胞实验室的Julian Asma。今天我将向您展示使用弹性蛋白酶注射制备新型实验性腹主动脉瘤的操作步骤。我们在实验室中采用此方法研究腹部动脉的PEs。现在开始实验。首先选择一只目标小鼠，例如C57黑六小鼠，并使用吸入式异氟烷对其进行麻醉，直至小鼠失去意识。请注意，不同品系的小鼠在动脉瘤生长速度上会有所差异。将麻醉后的小鼠从麻醉舱中取出，置于光线充足的准备台。从胸骨末端至腿部根部剃除腹部毛发。使用脱毛膏去除残留的毛发。用70%酒精擦拭裸露的皮肤，直至剃毛区域的所有毛发被清除干净。然后用聚维酮碘棉签擦拭皮肤至少三次，每次擦拭之间用酒精脱碘。现在，将小鼠仰卧位放置于手术区域，以保持小鼠处于无意识状态。手术期间，将一根导管置于其鼻部，以与诱导麻醉相同的流速输送异氟烷。将弹性蛋白酶保持在冰上，并抽取至注射器中。然后将注射器夹住并放置在手术区域旁边，连接导管。保持导管尖端无菌至关重要，可通过将尖端置于无菌小瓶中实现。在切开小鼠之前，确保采用无菌操作技术。首先戴上无菌手套。手术器械、剪刀、持针器和镊子在手术前必须进行消毒。请花点时间仔细检查您的准备工作，并尽量消除手术过程中可能存在的其他污染源。如果在操作过程中无菌技术被破坏，请立即使用热珠灭菌器重新对器械进行灭菌。一切准备就绪后，从腹腔内开始进行腹部正中长切口，进入腹腔。将腹腔内容物移至游离腹腔间隙，或用无菌纱布将其牵拉至腹腔外，以暴露腹主动脉。随后使用镊子仔细游离腹主动脉，从左肾静脉水平至其分叉处。在所示情况下，存在一条分支位于我们结扎主动脉的位置上方，因此无需结扎。如果在远端和近端主动脉结扎位点之间存在主动脉分支，则需使用10-0缝线在距分叉处1厘米范围内结扎这些分支，并在主动脉的近端和远端位置放置临时的6-0丝线结扎以阻断血流。现在在分叉处进行断体操作。首先用30号针头穿刺分叉处。可通过主动脉断体处插入加热后变细的聚乙烯导管，并用结扎线固定。使用镊子小心轻柔地将导管插入主动脉。注意不要因施加 100 毫升的压力而剥离内皮层。通过悬挂于 136 厘米高度的生理盐水袋，以含弹性蛋白酶的汞灌注主动脉。确保导管内无空气，否则压力将不准确。生理盐水含有每毫升4.5单位的I型猪胰弹性蛋白酶，应在5至15分钟内灌注至主动脉。灌流过程中，主动脉通常会扩张至其原始直径的约140%。操作完成后，移除灌流装置，并使用10-0缝线闭合主动脉切口，以避免狭窄。切口闭合后，远端结扎线也必须予以移除。如果修复后的主动脉切口出血较少或无出血，则移除近端结扎线。如果存在出血部位，需在主动脉的近端和远端加用额外的临时6.0缝线结扎，并再缝合一针以完全闭合主动脉切口。移除近端结扎线后，扩张的主动脉将立即充盈血液。当完成主动脉的操作后，将肠管复位至腹腔内。如果此前被牵拉，肠管会作为一个整体自然滑入腹腔，无需担心其形态排列。待所有器官复位后，可用6-0的尼龙线和聚丙烯缝线分两层缝合外部切口。现在为小鼠提供局部麻醉，例如每厘米切口给予一滴0.25%的ICAN（boop）。同时通过皮下注射给予一次剂量的抗炎药物Carin，剂量为每千克体重5毫克。手术现已完成，应将小鼠放置在温暖的区域，使其恢复意识。恢复通常在15分钟内发生。当小鼠恢复意识后，将其放回单独的笼子，并在恢复期间进行定期监测。手术后，主动脉通常会扩张至其原始直径的140%至160%。这种初始扩张在第7天时趋于稳定。在第7天至第14天之间发生快速的继发性扩张。在第14天时，可在肾下腹主动脉观察到动脉瘤。我刚刚向您演示了如何在小鼠中使用弹性蛋白酶诱导腹主动脉瘤。进行此操作时，重要的是要避免在主动脉内形成任何血栓。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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