Name: 个别细胞散为主细胞学标本的细胞块的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学习Shidham细胞块制备方法，利用AV标记物处理散在细胞学标本，通过离心和HistoGel包埋技术提高免疫组化与特殊染色的分析准确性。该方法适用于细胞病理学研究。

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作者感谢 Chris Chartrand（美国临床病理学会认证医学技术专家，HT(ASCP)）演示使用 AV 标记物对细胞块进行切片。

引言：
本视频介绍了Shidham法利用HistoGelTM（Thermo Scientific）（HG）从基于液体的细胞学（LBC）标本中制备细胞块的方法。与其他随机方法相比，本方案具有以下两个关键特点，适用于细胞含量相对较少、细胞呈单个散在分布的标本（1-5）。
<ol>
<li>本方案包含将细胞沿细胞包埋块切面平行平面进行集中的步骤。</li>
<li>还包括一个类似信标样的深色包含物（AV标记物，见图1b），其具有以下两个作用：<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>用于可视化显示细胞集中的层面。当切片过程中暴露出深色信标时，组织技术员即可识别出含有目标细胞的细胞包埋块区域。该监控能力可避免切穿细胞最集中的层面，或过度浅切至样本细胞浓度最高的层面。</li>
<li>作为不同载玻片上连续细胞包埋切片中的定位参考点。该参考点作为信标，有助于在采用SCIP方法（6,7）评估坐标免疫反应模式时，定位特定细胞或细胞群。</li>
</ol></li>
</ol>
方案（图2）
样品制备。
<ol>
<li>将残留的LBC宫颈细胞学标本转移至平底玻璃管（15 mm直径 × 45 mm）中（见图2.1至2.4）。将玻璃管放入较大的塑料承载管（28 × 85 mm）中，进行离心。从承载管中取出玻璃底管，倾倒上清液。</li>
<li>随后将玻璃管加盖（以防止下一步加热过程中水溢出），并重新放回较大的平底塑料承载管中。</li>
<li>将装有玻璃管的塑料承载管加盖后放入离心机（需使用摆动吊篮式离心机，而非固定角度转子，以确保细胞垂直沉降到玻璃管的平底），在1805 G（3000 rpm，转子半径17 cm）条件下离心5分钟（见图2.5）。</li>
<li>离心结束后，垂直取出离心管，并用镊子将较小的玻璃管从较大的塑料承载管中取出，注意不要扰动已沉淀的细胞沉淀物。</li>
<li>打开玻璃管盖，小心倾倒上清液，避免扰动管底平坦的细胞沉淀层（见图2.6）。</li>
</ol>
加入参考坐标 AV 标记物并添加凝胶
<ol>
<li>将一个深色信标 AV-marker（约 2 mm × 2 mm 大小，表面平整，由深色可切片材料制成的小片）（图 3）作为标记物加入玻璃管中（图 2.7）。</li>
<li>取一份 HG 样品，用中等功率微波加热 10 秒使其熔化。</li>
<li>向管中加入 0.5 ml 熔融的 HG，迅速与沉淀物混合，并立即盖上盖子（图 2.8）（需迅速进行下一步操作，防止 HG 开始凝固）。</li>
<li>向载体塑料管中加入约 2.5 ml 温热（45°C）的水（图 2.9）。</li>
<li>将较小的带盖玻璃管垂直放入盛有温水的塑料管内（此步骤旨在防止 HG 在后续操作中过早凝固）（图 2.9）。</li>
<li>将装有玻璃管的塑料管置于离心机中（必须使用带摆动吊篮的离心机，而非固定角度转子，以确保细胞垂直沉降到玻璃管的平底端），在 1805 G（3000 转/分钟，转子半径 17 cm）条件下离心 5 分钟。该离心步骤的目的是推动 AV-marker，并将细胞浓缩至更靠近最终石蜡包埋细胞块切面的一侧（图 1d）。</li>
<li>随后小心地垂直取出离心后的管子，注意不要扰动底部已沉积的薄层细胞样本。</li>
<li>打开大号塑料管的盖子，用镊子垂直取出小号玻璃管，过程中避免扰动标本细胞的沉淀层。</li>
<li>将小号玻璃管垂直放入冰箱冷藏 15 分钟，使 HG 冷却并完全凝固（图 2.11）。</li>
</ol>
将含标本的凝胶块作为整体取出，进行最终处理
<ol>
<li>将10%甲醛通过注射器连接23号针头，从平底玻璃管底部注入，使凝固的HG圆盘及其底部的浓缩/沉淀样本层脱离管底（图2.12）。</li>
<li>将针头沿试管侧壁插入已凝固的含标本HG培养基圆盘边缘处（图2.12）。</li>
<li>将针头沿试管侧壁旋转，同时缓慢推动福尔马林溶液通过注射器。这会导致HG栓连同深色的AV标记物及其内部浓缩样本从玻璃试管的平底分离（图2.12）。</li>
<li>将细胞块（含标本细胞的凝胶小块）放入已标记的包埋盒中，送检 组织处理 制备石蜡包埋的细胞块（图 2.13）。</li>
</ol>
样品的包埋与切片
<ol>
<li>将圆盘的深色信标标记面朝下作为切割面，包埋于石蜡中（图1）。</li>
<li>切片至深色的 AV-标记物作为信标暴露并清晰可见为止。</li>
<li>从此层面切取3至4微米厚的切片，该层面应含有标本中大部分单个散在的细胞。</li>
<li>将切片收集到载玻片上，用于后续染色、免疫组织化学染色或其他指定检测。这些检测的具体方案（包括用于贴附切片的载玻片类型）可能有所不同。通常在免疫染色中使用涂层载玻片，以防止切片在免疫染色过程中从载玻片上脱落或漂浮丢失。</li>
</ol>
使用的缩写（按字母顺序排列）： CISH，染色原位杂交检测；FISH，荧光原位杂交检测；FFPE，甲醛固定石蜡包埋；FNA，细针穿刺；HG，HistoGel™（Thermo Scientific）；LBC，液基细胞学；PCR，聚合酶链式反应；
 
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="石蜡包埋细胞块示意图：结构标注有石蜡、AV标记物、凝胶、细胞层细节。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 采用Shidham方案制备的细胞块结构。
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="使用Histogel和AV标记步骤进行细胞沉淀制备的离心流程图" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 图2. 采用Shidham方案从液基细胞学标本制备细胞块的不同步骤概要。
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="使用墨水和福尔马林方法从香蕉皮制备AV标志物的流程图" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 3"> 图3. 从香蕉皮制备AV标志物。
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="细胞块表面比较；组织学切片中标记物的可见性；图示分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 4"> 图4. 含AV标记物与不含AV标记物的细胞块及切片比较。
<img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="组织学染色比较，HE染色，低/高倍镜，有/无AV标记物，显微镜图像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 5"> 图5. 含AV标记物与不含AV标记物的细胞块切片细胞密度比较。

<ol><li>Shidham, V. B., Epple, J. Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShidham%2C+VB+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. Forthcoming.</li>
<li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens. Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. 2009 Mar 7-13, Boston, Ma, , Abstract 424 97a-97a (2009).</li>
<li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li>
<li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22CytoJournal%22%5BJournal%5D)">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li>
<li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytol%22%5BJournal%5D)">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li>
<li>Atkinson, B. F. Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtkinson%2C+BF+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).</li>
<li>Shidham, V. B. Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShidham%2C+VB+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).</li>
</ol>

细胞块是评估各种细胞学标本的重要工具（1）。尤其重要的是，除了标本的组织结构特征外，细胞块还可用于进行免疫细胞化学、荧光/显色原位杂交检测（FISH/CISH）以及原位PCR等辅助研究。已有多种制备细胞块的方法被报道。然而，这些方法大多适用于含有相对较多细胞及组织微碎片的非妇科细胞学标本，例如细针穿刺抽吸物以及某些浆膜腔积液（如胸腹水）（1,3,4,5）。
由于细胞块主要为免疫细胞化学检测提供了机会，其处理方式应尽量与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织相似。最终，细胞块切片免疫细胞化学检测的结果需要与主要基于FFPE组织切片发表的文献结果进行比较。任何对实验流程的改动都可能影响并削弱采用不同于常规FFPE所用固定剂和试剂流程处理的细胞块所得结果的有效性。某些商业技术可能存在缺陷，其流程涉及其他固定剂和试剂的处理步骤。
对于含有大量沉淀物和组织碎片的标本，可采用多种细胞块制备方法。主要原理是利用某种凝胶或凝固机制来支撑浓缩后的沉淀物。随后，经处理后的可操作小块组织可像外科病理标本或活检组织一样包埋于石蜡中。
所使用的凝胶包括明胶、琼脂、纤维蛋白原/血浆-凝血酶凝胶，以及其他商业凝胶如 HG。浓度的处理方法从通过离心简单沉淀浓缩细胞，到利用各种类型的膜对细胞进行浓缩不等。例如：Millipore 滤膜、火棉胶（Celloidin）袋，或从载玻片上的细胞学涂片上刮取细胞（1）。我们还通过尝试不同比例的琼脂与明胶组合评估了多种凝胶。然而，这些组合均未能达到足够坚固的一致性，无法从标本中完整地获得含有嵌入细胞的、易于操作的凝胶固化圆盘。HG 具有合适的一致性，根据我们的经验，其在 HG 细胞块切片上的免疫染色结果非常理想。
如上所述，用于宫颈阴道细胞学的基于液体的细胞学（LBC）标本通常比非妇科标本的细胞含量更少。此外，妇科LBC标本主要含有来自宫颈阴道黏膜的单个散在脱落的表层细胞。由于这一特点，若不采用特殊方法，可能难以在细胞块切片中获得足够的细胞量。由于组织技术员在切片过程中无法观察到细胞块中这些散在的细胞成分，因此难以判断细胞在切片中开始出现的层次，可能导致错过含有最多细胞的层次——要么切过了细胞最丰富的层次，要么未足够深入细胞浓度最高的层次（图4）。Shidham方案通过使用HG作为包埋介质以及常规实验室设备，解决了这两个问题（2）（图2）。
本方案包含以下两个主要特征（图1）：
<ol>
<li>将单个分散的细胞浓缩并排列在紧邻且平行于细胞包埋块切面的一个狭窄平面上（图5）。</li>
<li>加入类似信标样的深色AV-标记物作为指示标志。这对于实现以下特性至关重要：<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>识别并监测细胞在细胞包埋块中的浓缩层面。深色标志物的暴露提示了细胞包埋块中大多数单个分散细胞预期所在的位置（图4）。 这可防止对细胞包埋块进行过度切割（切过含有最多细胞的层面）或切割不足（未充分切入细胞浓度最高的层面），从而能够选择出细胞包埋块中细胞浓度最高层面的切片。</li>
<li>切片中的深色标志物还可作为参考点，用于在不同载玻片上细胞包埋块的连续切片中精确地定位和识别相同的细胞（图4）。在采用SCIP方法追踪特定细胞在不同切片中的坐标特性（如免疫表型）时，这一点至关重要（6,7）。</li>
</ol></li>
</ol>
尽管我们的方案已标准化并针对液基宫颈细胞学标本进行了报告，但它也可用于提高许多其他非妇科标本的诊断检出率，例如浆膜腔积液、细针穿刺（FNA）、刷取物、囊肿内容物等。此外，AV标记物将有助于在对这些标本的细胞块切片进行免疫组织化学评估时更好地应用SCIP方法。包埋介质可根据相应步骤进行适当修改，替换为其他试剂。HG可用血浆（纤维蛋白原）替代，并在室温下通过凝血酶作用形成凝胶（1）。

细胞散在为主的细胞学标本的细胞块制备

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

本视频演示了Shidham法，用于制备来自液基宫颈阴道细胞学标本的细胞块，这些标本含有散在的单个细胞和小细胞团。该技术采用HistoGel（Thermo Scientific）并结合常规实验室设备完成。
细胞块切片在非妇科细胞学评估中是一种有价值的辅助工具。它们使细胞病理学家能够研究更多的形态学标本细节，包括病变的组织结构。最重要的是，它们可用于进行辅助检测，例如免疫细胞化学、原位杂交检测（FISH/CISH）以及原位聚合酶链式反应（PCR）。传统的细胞块制备技术主要应用于非妇科细胞学标本，通常用于体液渗出物和细针穿刺活检样本。
基于液体的宫颈阴道标本的细胞含量通常低于非妇科来源的标本，常表现为大量分散的单个细胞。由于这一特点，要在细胞块切片中获得足够的细胞量较为困难。此外，制片的技术人员在切片时无法直观判断细胞浓度最高的所在层面，因此难以监控并选择合适的切片层面转移至玻片进行检测。结果可能导致含有目标细胞的细胞块区域被遗漏，要么切过头，要么切得不够深。目前 Shidham 方法的标准操作流程已针对上述问题进行了优化。尽管该方案最初是为妇科液体基细胞学标本制定并报道的，但也可应用于非妇科标本，如浆膜腔积液、细针穿刺样本、刷取物、囊肿内容物等，以提高细胞块切片中诊断性材料的质量。

Shidham 法制备含 AV 标记物的细胞块，适用于含有散在单个细胞和小细胞团的细胞学标本。

本视频演示了Shidham法对含有散在细胞的液基宫颈阴道细胞学标本进行细胞块制备的方法。

细胞块制备首先将浓缩后的标本细胞转移至置于较大试管内的平底玻璃管中。通过离心使细胞沉积于管底后，加入AV标记物和熔化的HistoGel。向承载玻璃管中加入温水可确保HistoGel保持液态。随后的离心步骤会推动AV标记物穿过凝胶，并将细胞浓缩至接近细胞包埋块切面的一层。凝固后，可取出凝胶块并进行石蜡包埋处理。大家好，我是来自威斯康星州密尔沃基市威斯康星医学院病理学系细胞学部门的George Varszegi博士。我是来自威斯康星医学院密尔沃基分校病理科细胞病理学部门的 Dr. Vsam。今天我们将向您展示一种从以单个散在细胞为主的细胞学标本制备细胞块的实验方法。我们使用该方法对细胞块切片中的单个散在细胞进行免疫表型分析，同时也用于这些切片的特殊染色评估。那么，让我们开始吧。首先，取约0.5毫升的浓缩样本，转移至一支长45毫米、直径15毫米的平底玻璃管中。接着，将该玻璃管放入一个较大的平底塑料载体管中，在室温下以1800 ×g离心5分钟。离心后，将平底玻璃管从塑料载体管中取出，倒出上清液，注意不要扰动底部平坦的细胞沉淀层。向细胞中加入 Johnny Vena 或 AV 标记物作为指示标志。细胞包埋后，使用AV标记物来确定细胞在石蜡块中的集中位置。使用特殊移液器将预先制备好的具有平面表面的AV标记物立方体加入到管中的细胞中。接着开始添加凝胶的过程：取一份组织凝胶（histo gel或HG），通过中等功率微波加热10秒使其熔化，或按照制造商的说明进行操作，使其液化。向含有沉淀细胞的离心管中加入 0.5 毫升熔化的 HG。迅速混匀并盖上管盖。立即向载体塑料管中加入约 2.5 毫升、45 摄氏度的温水。然后插入含有细胞、AV标记物和HistoGel的CAPAs管。操作时应迅速进行，并使用温水，以防止凝胶在后续步骤中凝固。接着进行离心，使AV标记物穿过凝胶，同时将细胞浓缩成一层，使其更接近最终石蜡包埋细胞块的切面表面。使用摆动吊篮离心管而非固定角度离心管，使细胞垂直沉淀至玻璃管平底处，并在室温下以1800 ×g离心5分钟。离心完成后，轻柔且垂直地从离心机中取出离心管，注意不要扰动管底的薄层细胞沉淀。使用镊子垂直取出内层较小的玻璃管，避免扰动标本细胞的沉淀层。最后将小玻璃管垂直放置于冰箱中冷藏15分钟，使凝胶冷却并凝固。15分钟后，将含有细胞的凝胶从玻璃管中取出，以分离出已凝固的HG圆盘，该圆盘底部含有一层浓缩的样本以及深色的AV标记物。使用连接注射器的23号针头，注射器内装有10%formin。首先将针头沿试管侧壁插入已凝固的琼脂糖凝胶圆盘边缘处。接着，在缓慢推动福明溶液通过注射器的同时，沿试管侧壁旋转针头。观察琼脂糖凝胶小柱从玻璃试管平底分离的过程。将含有深色信标AV标记物和浓缩样本的分离凝胶按钮称为细胞块，将其放入已标记的包埋盒中，并送交组织处理以制备石蜡包埋的细胞块。细胞块包埋完成后，开始切片：将石蜡包埋的细胞块安装在切片机上，先进行粗切以修平石蜡块表面，并暴露细胞块的切面，直至深色AV标记物清晰可见。一旦深色AV标记物暴露，即切取3至4微米厚的切片。这些切片含有来自原始标本的浓缩细胞。将每一片切片收集到玻片上，进行后续染色，然后进行显微镜检查。在此低倍放大图像中，我们可以观察到在标本中加入以墨水标记的香蕉皮作为解剖方位标记物后，对这些苏木精-伊红染色切片中细胞密度的影响。从左侧图像中可以看出，该标记可用于监测切片深度，以获得细胞含量良好的切面。房室（AV）标记还可用于确定不同细胞的方向，特别是通过该标记可在其他载玻片上的连续切片中追踪特定切面。若无此标记，则无法监测切片深度。在细胞稀少的切面处采集了组织样本。在高倍镜下，样本中的细胞含量程度更为明显；由于存在AV标记物，切割深度可轻松监测，从而可轻易避免获取细胞含量不足的样本。我们已向您展示了一种从含有松散分布碎片和细胞的标本制备细胞块的方法。我们在细胞块处理过程中添加的深色AV标记物，有助于选择细胞浓度最高的切片区域，同时也便于将这些切片在玻片上进行正确的定位。在细胞沿灌注板底部玻璃管（即切割面）排列时，组织凝胶必须保持在熔融状态，这一点至关重要。然而，通过相应的修改，该方法也可适用于其他冷处理方法，包括凝血酶、纤维蛋白原等。就此结束。感谢您的观看，祝您的实验操作顺利成功。谢谢。

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