Name: 人类胰岛的分离:第二部分:人类胰岛的分离纯化及文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学习人类胰岛的分离纯化与培养技术，采用改良自动化密度梯度离心法从胰腺组织中获取高质量胰岛细胞。该方法可确保胰岛活性与纯度，为临床移植治疗糖尿病提供可靠的技术支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

由伊利诺伊大学芝加哥分校、胰岛细胞资源中心NIH资助（RFA-RR 05-003）、克里斯托弗基金会、埃夫罗姆森基金会和特拉布斯基金会提供支持。

1. 胰岛的纯化
<ol>
<li>开始胰岛纯化操作时，将COBE袋连接好，夹紧除绿色管以外的所有管路，并将转速设为1,500，超速排出（super out）设为0。</li>
<li>在生物安全柜内设置好泵和梯度烧杯，并将收集管路连接至绿色管。</li>
<li>现在开始加载ficoll 1.100：按下“spin”按钮，然后向前面的烧杯中加入110 ml Ficoll 1.100，并启动泵以将液体加载入COBE袋。当Ficoll开始加载后，按下超速排出按钮，停止泵，松开泵头夹子，并将超速排出速度设为100。</li>
<li>当Ficoll到达烧杯且管路中的空气完全排出后，重新在泵头处夹紧管路。将旋转速度设为3,000，超速排出速度设为0。</li>
<li>现在准备加载梯度液：将高密度梯度液倒入前面的烧杯中。略微松开两个烧杯之间的夹子以排除任何气泡，然后将低密度梯度液倒入后面的烧杯中。</li>
<li>打开磁力搅拌器，按下COBE仪器上的“spin”按钮，松开连接两个烧杯的管夹，并目视确认高密度和低密度梯度液正在混合。</li>
<li>一旦梯度液开始混合，启动离心机。等待一分钟，然后开启泵以加载混合后的梯度液。</li>
<li>加载组织时，让前面烧杯中的梯度液面降低，但不能过低以致空气进入加载管路，随后夹紧连接两个烧杯的管路，并加载组织样本。</li>
<li>继续加入剩余的组织样本。然后用50 ml洗涤液冲洗盛装组织的管子，并用该液体冲洗前面的烧杯。</li>
<li>当最后的组织进入COBE袋时，同时停止泵，松开泵头处的夹子，并夹紧袋上方的管路。继续离心5分钟。</li>
<li>在离心过程中，将12个收集管移至生物安全柜内并松开其管盖。将收集管路连接至黄色管，将无菌收集尖端插入锥形管1中。然后松开黄色管的夹子，夹紧绿色管。</li>
<li>当离心结束后，缓慢将超速排出调至100。在第1管中收集150 ml，然后在第2至第12管中各收集30 ml（总体积从200至230 ml）。</li>
<li>收集完成后，在COBE仪器上按下“STOP”按钮。至此纯化过程结束，可对胰岛进行评估和培养。</li>
</ol>
2. 取样与培养
<ol>
<li>收集纯化的胰岛组分后，从12个收集管中各取出一份样品，用二苯硫腙（Dithizone）染色。染色结果可显示哪些层含有高纯度胰岛，哪些层含有低纯度胰岛。</li>
<li>分别收集高纯度和低纯度组织，并各自合并。</li>
<li>离心并洗涤两次。第二次洗涤后，用终末洗涤液将每份体积调至250 ml。</li>
<li>为评估合并后的组分，首先从高纯度合并组分中取两份1 ml样品，从低纯度合并组分中取一份1 ml样品，分别转移至含有9 ml洗涤液的锥形管中。</li>
<li>然后将每支15 ml管中的1 ml样品转移至计数皿中，在显微镜下观察并计数细胞。</li>
<li>细胞计数后，根据以下公式计算培养胰岛所需的培养瓶数量：（总EIN / 胰岛纯度（小数形式））/（每瓶30,000 EIN）。例如，100,000个纯度为90%的胰岛需在4个培养瓶中培养。</li>
<li>将胰岛转移至T175培养瓶中，在37˚C、5% CO2的培养箱中进行培养。</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

尽管人胰岛分离技术已取得显著进展，胰岛产量仍然存在高度变异性且难以预测。在成功进行酶消化后，为了获得足够的胰岛组织用于移植，消化后胰腺组织的纯化至关重要。推荐采用UIC纯化方法，因为该方法已被证明可实现高纯度人胰岛的更优回收。此外，单次Cobe离心运行可加载多达50 ml的消化组织，从而通过缩短整个分离过程所需时间，减少与缺血相关的人胰岛损伤。

<table><tbody><tr><td>离心机</td><td>设备</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Cobe 2991 细胞处理仪</td><td>设备</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>胰岛纯化</td></tr><tr><td>MZ6 倒置显微镜 TLBD4.1</td><td>设备</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>带2 mm网格的细胞培养皿</td><td>设备</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>胰岛计数</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>设备</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>COBE袋</td><td>一次性设备</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>T175培养瓶</td><td>一次性设备</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>威斯康星大学（UW）溶液</td><td>试剂</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s缓冲盐溶液（HBSS）</td><td>试剂</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>试剂</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>M199培养基（洗涤液）</td><td>试剂</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>终末洗涤/培养培养基</td><td>试剂</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>二苯硫腙</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

人胰岛分离：第二部分：人胰岛的纯化与培养

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

1型糖尿病的管理对个人和社会而言都是一项沉重的负担，每年花费超过1000亿美元。尽管血糖监测和新型胰岛素制剂已广泛应用，许多患者仍会出现严重的继发性并发症。胰岛移植能够恢复糖尿病患者的近似正常血糖控制1，且不会出现与强化胰岛素治疗相关的严重低血糖发作风险。提供足够的胰岛组织量对于成功的胰岛移植至关重要。然而，供体特征、器官获取及保存过程均会影响胰岛分离的效果2. 在芝加哥伊利诺伊大学（UIC），我们开发了一种成功的分离方案，并优化了纯化梯度3. 该项目始于2004年1月，截至2008年11月已完成了300多次分离。胰腺组织以低温保存液（UW，威斯康星大学液或HTK，组氨酸-色氨酸-酮戊二酸液）送至实验室4-7送往伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）的细胞分离实验室进行胰岛分离。胰岛采用UIC方法进行分离，该方法是Ricordi最初描述的方法的改良版本。等 8如第一部分“胰腺组织的消化与收集”所述，人胰腺经过修剪、插管、灌注和消化处理。收集组织后，在UW溶液中至少孵育30分钟，随后将组织装入细胞分离机（COBE 2991，Cobe，Lakewood，CO）中进行纯化。3纯化后，根据标准方法测定胰岛产量（以胰岛当量，IEQ 表示）、组织体积和纯度。9分离的胰岛在CMRL-1066培养基（Mediatech，Herndon，VA）中培养，培养基中添加1.5%人血清白蛋白、0.1%胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、1 ml环丙沙星、5 ml 1M HEPES以及14.5 ml 7.5%碳酸氢钠，置于T175培养瓶中，于37°C过夜培养，之后用于移植或科研实验。

获得高质量且数量合适的胰岛是成功进行胰岛移植的重要前提之一。在本视频中，我们将逐步介绍使用改良的自动化方法分离人胰腺胰岛的步骤（第二部分：人胰岛的纯化与培养）。

1型糖尿病的管理对个人和社会而言都极为沉重，每年耗资超过1000亿美元。尽管广泛使用……

在本视频中，先前已分离并消化的胰腺组织将进行密度梯度纯化，以获得纯化的胰岛细胞组分，这些细胞最终可在组织培养瓶中进行培养，直至用于移植。大家好，我是来自伊利诺伊大学芝加哥分校外科系人类胰岛项目实验室的American Chief。大家好，我叫Barbara Barbero，我也来自人类胰岛项目。今天我们将向您展示一种人胰岛分离的方法。我们在本机构使用该方法来获取高质量的人胰岛，用于临床应用。让我们开始吧。开始眼孔纯化程序时，除绿色管外，使用 COBE 袋夹闭合所有管路，并在生物安全柜中将转速设为 1500，超速流出设为零。安装好泵和梯度烧杯，并将收集管路连接至绿色管。现在可开始 FI 细胞悬液的上样，进行推注离心。然后加入 110 毫升的 fi。将液体引向前方烧杯，并启动泵以加载 COBE 袋。在加载 fi 液体的同时，按下 super out。停止泵运行，松开泵头夹子，并将超速离心速度设为100。当流动注射信号到达烧杯且管路中的所有空气从泵头夹子处排出后，将旋转速度设为3000，超速离心速度设为零。现在开始准备加载梯度，将高密度梯度液稍微倒入前部的烧杯中。松开两个烧杯之间的夹子以排出所有空气。然后将低密度梯度液倒入后面的烧杯中。开启磁力搅拌器。按下COBE机器上的离心按钮。取下连接两个烧杯的管路上的夹子，并确认高密度和低密度梯度液正在混合。一旦梯度液开始混合，立即启动离心机。等待一分钟，然后打开泵以将混合梯度液加载至组织中。让前烧杯中的梯度液面降低，但不能过低以致空气进入加样管。随后夹紧连接烧杯的管路，并加载组织样本。继续加入剩余的组织。然后用50毫升洗涤液冲洗盛放组织的试管，并在组织完全进入袋子后，用该洗涤液冲洗前部烧杯。同时在泵头处停止泵并用UNC夹夹住管路，以及在袋上方夹住管路。继续离心五分钟。在离心进行的同时，将12个收集管移至生物安全柜并松开管盖。将收集管连接到黄色管子上，并将无菌收集尖端放入1号锥形管中。然后打开黄色管子的夹子，同时夹紧绿色管子。当离心结束后，缓慢将上清液吸出至100 µL。在1号管中收集150毫升，在2至12号管中每管收集30毫升。收集完成后，按下COBE仪器的停止按钮。纯化完成后，可对眼状体进行评估和培养。收集纯化后的眼状体组分后，从12个收集管中各取出一份样品，用二酮染色。染色结果将显示哪些层含有高纯度的眼状体，哪些层纯度较低。眼孔收集高纯度和低纯度组织，分别合并，离心并洗涤两次。第二次洗涤后，用终末洗涤缓冲液将每份体积调至250毫升。为评估合并的组分，首先从高纯度合并组分中取两份1毫升样品，从低纯度组分中取一份1毫升样品，将每份1毫升样品转移至含有9毫升洗涤液的锥形管中。然后从每个15毫升管中转移1毫升至计数皿中。在显微镜下观察并计数细胞。计数后，使用以下公式计算培养小孔所需的培养瓶数量：总EIN除以小孔纯度（以小数形式

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人类胰岛的分离：第二部分：人类胰岛的分离纯化及文化

获得高质量且数量合适的胰岛是成功进行胰岛移植的重要前提之一。在本视频中，我们将逐步介绍采用改良自动化方法进行人胰腺胰岛分离的操作流程（第一部分：胰腺组织的消化与收集）。...

人胰岛分离：第一部分：胰腺组织的消化与收集

用于研究的2型糖尿病胰岛供应不足。本文分享了我们从接受部分胰腺切除术的患者中分离胰岛的实验方案。该方法为获得足量的2型糖尿病患者及临床匹配的非糖尿病受试者的胰岛提供了独特途径，可用于基础与临床研究。...

从部分胰腺切除患者中分离人类胰岛

胰岛，也称为朗格汉斯岛，是一类内分泌细胞簇，可产生调节葡萄糖及其他重要生物学功能所需的激素。本方案介绍了一种从小鼠胰腺中分离胰岛的方法：首先通过十二指肠乳头灌注胶原酶，以消化外分泌胰腺组织，再采用简化的密度梯度离心法纯化胰岛。...

通过胶原酶灌注法分离胰岛：一种分离胰岛细胞的酶消化方法

糖尿病研究领域面临的关键挑战是阐明调控胰岛β细胞复制的分子机制，并开发出促进β细胞再生的方法。本文介绍了一种高内涵筛选方法，用于鉴定和评估小分子促进β细胞复制的活性。...

高内涵 体外 胰腺胰岛β细胞复制发现平台

在此，我们描述了用于并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外...

平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

本文介绍了一种从新生小鼠中分离完整胰岛的实验方案。胰腺经胶原酶部分消化后，进行洗涤和手工挑选。每只新生小鼠胰腺可获得20 -...

从新生小鼠胰腺中有效分离功能性胰岛

本胰岛分离方案描述了一种新型的胶原酶注射途径，用于消化外分泌组织，并采用简化的梯度步骤从小鼠中纯化胰岛。该方法包括酶消化、梯度分离/纯化以及人工挑选胰岛。成功分离可每只小鼠获得250–350个高质量且功能完整的胰岛。...

一种简单高效的小鼠胰岛分离方案

本文介绍了一种利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，从分离的人胰岛中生成高质量、大规模单细胞转录组数据的实验方案。...

单细胞RNA测序及人胰岛分析

本方案提供了用于胰岛分离与纯化的猪胰腺获取的逐步操作指南。...

用于胰岛分离的猪胰腺手术灌注与分离

本方案描述了一种标准化的方法，用于Lewis大鼠胰岛的手术获取、酶消化及密度梯度纯化，可高效获得高纯度的胰岛，直接用于移植或后续实验研究。 体外...

采用酶消化法与密度梯度分离法从Lewis大鼠中分离与纯化胰岛组织

学习人类胰岛的分离纯化与培养技术，采用改良自动化密度梯度离心法从胰腺组织中获取高质量胰岛细胞。该方法可确保胰岛活性与纯度，为临床移植治疗糖尿病提供可靠的技术支持。

人胰岛分离：第二部分：人胰岛的纯化与培养

探索更多视频