Name: 人CD40激活的B细胞的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: 学习从外周血单个核细胞体外生成人CD40激活B细胞的方法，利用CD40配体和白介素-4刺激培养。该技术可高效扩增具有抗原呈递功能的B细胞，适用于免疫学和自身免疫疾病研究。

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从外周血单个核细胞（PBMC）生成人源CD40活化B细胞的实验方案分为两部分：A部分演示表达CD40配体的NIH/3T3饲养细胞的制备，该细胞将用作板结合的饲养层细胞；B部分描述实际的CD40-B细胞培养过程。
A. 饲养层细胞的制备（tCD40L NIH/3T3）
tCD40L NIH/3T3 是一种贴壁生长的小鼠成纤维细胞系，不应使其完全汇合。因此，细胞需每周传代两次。不建议培养超过 6 周。
<ol>
 <li>用无菌移液管吸除原代培养物中的旧培养基，并用 10 mL 的 1× PBS 洗涤细胞。洗涤后吸除 PBS。</li>
 <li>在 75 cm2 培养瓶中加入 4 mL 胰蛋白酶/EDTA，于 37°C 作用 5–10 分钟。轻轻敲击培养瓶以使细胞脱落。</li>
 <li>加入 10 mL 野生型培养基，轻轻旋转混匀。</li>
 <li>用无菌移液管将细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，在 225 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。</li>
 <li>吸除上清液，将沉淀重悬于 10 mL 野生型培养基中。取部分细胞悬液计数细胞数量，并根据所需细胞数准备三个 50 mL 离心管：
 <ol>
 <li>用于传代培养的 1.5 × 106 个细胞</li>
 <li>用于 CD40-B 细胞培养中照射的每孔 0.2 × 106 个细胞</li>
 <li>剩余细胞用于冻存（如需要）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>在 225 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。</li>
 <li>吸除上清液。
 <ol>
 <li>用于传代培养：将 1.5 × 106 个细胞重悬于 10 mL 野生型培养基中，接种至 75 cm2 细胞培养瓶（细胞密度为 1.5 × 105 个细胞/mL），加入 G-418 [0.7 mg/mL]，于 37°C、5% CO2 条件下培养。每周传代两次。</li>
 <li>用于 CD40-B 细胞培养：每块 6 孔板需要 1.2 × 106 个细胞。将细胞重悬于野生型培养基中，细胞密度为 0.1 × 106 个细胞/mL，然后在 78 Gy 条件下进行照射。每孔接种 2 mL 细胞悬液，于 37°C、5% CO2 条件下培养。当 tCD40L NIH/3T3 细胞贴壁后（至少 4 小时：需在显微镜下检查贴壁情况；开始 B 细胞刺激的时间不得超过 24 小时），即可使用制备好的饲养层板进行 B 细胞刺激。（继续进行步骤 B。）</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
B. CD40-B 细胞培养
I. CD40 刺激用 PBMC 的制备（第 0 天）：
请注意：在继续操作前，需确认饲养细胞已贴壁。每次使用前，务必在培养基中立即加入新鲜的白细胞介素-4和环孢素A溶液。
<ol>
 <li>取新鲜或适当复苏的外周血单个核细胞（PBMCs）。用50 mL 1× PBS重悬PBMCs两次以洗涤细胞，第一次以265 × g离心7分钟，第二次以190 × g离心7分钟，以去除其他细胞。弃去上清液，将细胞重悬于20 mL PBS中。取部分细胞悬液测定细胞数量。</li>
 <li>以225 × g离心5分钟，沉淀所需数量的细胞。对于6孔板，每孔需要4 × 106个细胞，因此每块板共需24 × 106个细胞。</li>
 <li>弃去上清液，将PBMC重悬于CD40-B培养基中，调整细胞密度为1 × 106个细胞/mL，培养基需新鲜添加50 U/mL白细胞介素-4（IL-4）作为生长因子，以及0.63 μg/mL环孢素A以抑制T细胞过度生长（所给浓度均指每毫升培养基中的含量！）。</li>
 <li>移除预先与tCD40L NIH/3T3细胞共孵育的6孔板中的上清液。</li>
 <li>先用每孔2 mL PBS洗涤贴壁的tCD40L NIH/3T3细胞，再用每孔2 mL CD40-B洗涤培养基进行第二次洗涤。</li>
 <li>轻柔地向6孔板的每个孔中加入4 mL PBMC悬液（1 × 106个细胞/mL）。</li>
 <li>将细胞置于37°C、5% CO2条件下培养。</li>
 <li>第7天时对细胞进行传代培养（继续执行3.2步骤）。</li>
</ol>
二、CD40-B 细胞的重新培养（第 7 天，之后每 3–4 天一次）：
<ol>
 <li>用10 mL移液器重悬6孔板中的CD40-B细胞团簇，并将其收集至50 mL离心管中。</li>
 <li>以225 × g离心7分钟，彻底弃去上清液，并用CD40-B洗涤培养基重悬细胞。在对部分细胞进行计数的同时，以225 × g再次离心5分钟。将CD40-B细胞以1 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于CD40-B培养基中。</li>
 <li>向培养基中加入终浓度为50 U/mL的白细胞介素-4和0.63 μg/mL的环孢素A新鲜溶液。</li>
 <li>移除预先与tCD40L NIH/3T3细胞共培养的6孔板中的上清液。</li>
 <li>先用每孔2 mL PBS洗涤贴壁细胞，随后再用每孔2 mL CD40-B洗涤培养基进行第二次洗涤。</li>
 <li>轻轻向6孔板的每孔中加入4 mL（1 × 106 个细胞/mL）CD40-B细胞悬液。</li>
 <li>将培养板置于37°C、5% CO2条件下培养。</li>
 <li>每3–4天传代一次，经过总计14天后获得高纯度的人源CD40活化B细胞。</li>
</ol>
C. 故障排除——如果CD40-B细胞不生长怎么办？
<ol>
 <li>您是否检测了饲养细胞的CD40配体表达？</li>
 <li>用于刺激的平板包被饲养细胞使用时间是否未超过24小时？</li>
 <li>是否存在支原体污染的可能性？</li>
 <li>用于补充的白细胞介素-4溶液是否为 freshly thawed（新鲜解冻），并具有适当的生物学活性？</li>
 <li>环孢素A是否以正确的浓度添加？</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="流式细胞术分析：CD标志物、荧光强度；图表显示免疫细胞活化研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 请点击<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">此处</a>查看图1的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="流式细胞术 FACS 示意图：SSC 与 FSC 散点图、CD154 表达直方图、荧光强度。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 图 2. 请点击<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">此处</a>查看图 2 的放大版本。

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td colspan="4">A. 培养基的制备：</td></tr><tr><td colspan="4">1. 饲养层细胞野生型培养基</td></tr><tr><td>DMEM-Ham&amp;rsquo;s / F12</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (365 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (10%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (10 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素 (15 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. 饲养层细胞筛选培养基</td></tr><tr><td>DMEM-Ham&amp;rsquo;s / F12</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (365 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (10%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (10 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素 (15 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>G-418 (0.7 mg/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. CD40-B 洗涤培养基</td></tr><tr><td>IMDM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (584 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (25 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素 (15 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. CD40-B 培养培养基</td></tr><tr><td>IMDM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (584 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (25 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素 (15 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组人转铁蛋白 (50 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组人胰岛素 (5 &amp;mu;g/mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB型人血清 (10%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">B. 其他试剂：</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM / Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No: E15-813</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Invitrogen</td><td>REF 21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS (10x)</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No H15-011</td><td></td></tr><tr><td>AB型人血清</td><td>Invitrogen</td><td>Cat No 34005100</td><td></td></tr><tr><td>全铁人转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat No T0665</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat No I2643</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素&amp;#174;</td><td>Delta Select</td><td>Art No 7395800</td><td></td></tr><tr><td>重组人白细胞介素-4</td><td>Immunotools</td><td>Cat No 11130045</td><td></td></tr><tr><td>环孢素A</td><td>诺华公司 (Novartis AG)</td><td>Cat No NDC 0078-0109-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza Inc.</td><td>Cat No DE14-802C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No S11-001</td><td></td></tr><tr><td>G-418硫酸盐</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No P02-012</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>REF 15400-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">C. 其他耗材：</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌移液器吸头</td><td>Sarstedt Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Nalge Nunc international</td><td>Cat No 140675</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat No 352070</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>Cat No 83.1813.002</td><td></td></tr></tbody></table>

人源cd40活化b细胞的制备

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40活化的B细胞（CD40-B细胞）已被确定为癌症免疫治疗中一种替代性的免疫刺激性抗原提呈细胞（APC）来源 1-3与树突状细胞（DCs）——目前研究最为透彻的抗原提呈细胞——相比，CD40激活的B细胞具有若干独特的生物学和实验操作特性。与DCs类似，B细胞在白细胞介素-4和CD40配体（CD40L）刺激后，MHC分子和共刺激分子的表达显著上调（图1b），表现出较强的迁移能力，并能高效地向T细胞提呈抗原。然而，与未成熟或成熟的DCs不同，CD40-B细胞表达完整的淋巴结归巢三联分子组合，包括CD62L、CCR7/CXCR4以及白细胞功能抗原-1（LFA1，CD11a/CD18），这些分子对于归巢至次级淋巴器官至关重要（图1a）。 3CD40-B细胞可从极少量外周血中无困难地制备，并可进一步扩增 体外 高纯度CD40-B细胞的大量制备（&gt;109 每位患者细胞数）来自健康供体以及癌症患者（图1c,d） 1,4. 
在本实验方案中，我们演示了如何从人外周血单个核细胞（PBMC）获得完全活化的CD40-B细胞。细胞培养的关键分子包括CD40配体、白细胞介素-4（IL-4）和环孢素A（CsA），这些成分需在每3至4天的培养周期中补充。在实验室条件下，CD40刺激由表达重组人CD40配体的NIH/3T3细胞（tCD40L NIH/3T3）提供5。为避免非转染细胞的污染，必须定期检测转染细胞表面人CD40配体的表达情况（图2）。 
14天后，CD40-B细胞培养物中B细胞纯度超过95%，且CD40-B细胞扩增可持续长达65天，通常不会丧失功能 1, 4CD40-B细胞能高效地摄取、加工并提呈抗原给T细胞 6它们不仅能够启动初始&#970;但也能扩增记忆T细胞 7,8CD40 激活的 B 细胞可用于研究 B 细胞的活化、分化和功能，此外，它们也是用于肿瘤治疗性或预防性疫苗的有前景工具 9.

在本视频中，我们介绍了通过CD40配体和白细胞介素-4刺激，从外周血单个核细胞（PBMC）中ex vivo生成并扩增人CD40活化B细胞（CD40-B）的方法。

人源CD40活化B细胞的制备

CD40活化的B细胞（CD40-B细胞）已被确认为可用于癌症免疫治疗的替代性免疫刺激性抗原提呈细胞（APC）来源……

大家好，我叫Alexander Shiku Van Hagen。我是科隆大学医院免疫学与移植免疫学实验室的成员。在本视频中，我们将向您展示如何从外周血单个核细胞诱导生成人CD40活化的B细胞。我们实验室的主要研究兴趣之一是探讨B细胞不依赖抗体的功能。除了作为抗体产生细胞外，B细胞在生理条件下以及自身免疫性疾病中均发挥重要的抗原提呈细胞作用。活化后，B细胞可获得强大的抗原提呈能力和免疫刺激能力，尤其是通过CD40活化时。CD40。与树突状细胞相比，活化的B细胞具有多种优势。即使是从癌症患者的小量外周血中，也能以相对较低的成本轻松扩增活化B细胞。现在，我们的博士生Tanya Leic和实验员LER将为您逐步介绍如何从外周血中制备人CD40活化的B细胞。大家好，我叫Tanya Livi，是一名博士生，我将向您演示如何制备人CD40活化的B细胞。该实验步骤已在我们的实验室中优化。主要步骤首先是制备饲养细胞。我们使用转染了人 CD40 配体的 NIH 3T3 细胞，经 78 Gy 照射后，接种至 6 孔板中。其次，我们开始培养人CD40激活的B细胞，这些细胞来源于经纯化的外周血单个核细胞（PBMC），并用人类白细胞介素-4和环孢素A处理，随后将这些细胞接种到六孔板中的饲养细胞（fetal cells）上。该操作在第7天重复一次，之后每3至4天重复一次，直至细胞培养的第14天。为了获得高纯度的人CD40激活的B细胞，我们使用 freshly purified 或适当保存的人PBMC来启动CD40激活的B细胞的生成。首先，我们将 PBMC 洗涤两次，即用 50 毫升 PBS 重悬细胞。在 1300 转/分钟（相当于 260 ×g）条件下离心 7 分钟。弃去上清液，再用 50 毫升 PBS 重悬细胞，并在 1100 转/分钟（相当于 190 ×g）条件下再次离心 7 分钟。再次弃去上清液，用于后续细胞计数的测定。将PBMC重悬于20毫升PBS中，通过涡旋充分混匀细胞，并测定细胞数量。根据所需数量，以1200转/分钟（相当于220.5 ×g）离心5分钟收集用于CD40-B培养的PBMC。使用六孔板时，每孔需要4 × 10⁶个细胞，每块板共需24 × 10⁶个细胞。然后将PBMC重悬于CD40-B培养基中，密度为每毫升1×10⁶个细胞。在细胞悬液中加入新鲜的人IL-4，终浓度为50单位/毫升，用于刺激；同时加入浓度为0.63 µg/mL的环孢素A，以抑制T细胞的生长。此时，PBMC悬液已准备好用于CD40配体的刺激。据我们所知，目前尚无功能性GMP级SOMAL CD40配体可供使用。因此，我们采用转染了人CD40配体的NIH/3T3细胞来刺激细胞的存活、分化和增殖，因为NIH/3T3细胞系可在培养中存活数月。必须定期通过实验排除CD40配体表达的丢失情况。CD40配体转染的NIH 3T3是一种贴壁细胞系，在含有0.7毫克/毫升G418的筛选培养基中，于37摄氏度、5% CO2条件下培养。该贴壁成纤维细胞系不应让其完全汇合，应每周传代两次。传代贴壁细胞时，吸除培养基，用10毫升PBS轻柔振荡洗涤一次，再次吸除液体，然后在75平方厘米培养瓶中加入4毫升胰蛋白酶-EDTA溶液。将烧瓶放入培养箱中，在 37 度条件下孵育 5 至 10 分钟。再次取出烧瓶，轻轻敲击以使细胞从塑料表面脱落。然后轻轻加入10毫升野生型培养基并轻柔混匀，将细胞转移至50毫升离心管中。以1200转/分钟（相当于125 × g）离心5分钟，沉淀NA83T3细胞。用10毫升野生型培养基小心重悬沉淀的细胞。确定NIH 3T3亚培养物的细胞数量，并将1.5 × 10⁶个饲养细胞重悬于10毫升野生型培养基中。将其转移至75 cm²培养瓶中，并加入G418至终浓度为0.7 mg/mL，以筛选携带新霉素抗性基因的转染细胞。最后将饲养细胞置于37°C、5% CO₂条件下培养，用于CD40 B细胞刺激。取剩余的NI 8 3 3细胞，用78 Gy剂量进行致死性照射，以阻止其增殖。将照射后的饲养细胞用wire type培养基稀释，细胞密度为0.1 × 10⁶ 个细胞/毫升，每孔加入2毫升，接种于6孔板中。将6孔板中的细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时，使其重新贴壁后，作为饲养细胞用于CD40配体刺激B淋巴细胞。在显微镜下检查前一天接种的饲养细胞是否已贴壁。如果饲养细胞已经贴壁，移除每个孔中的SUP natin，并迅速洗涤两次：第一次用2毫升PBS洗涤每个孔，第二次用2毫升PBS洗涤。用于PBMC悬液刺激的CD40B洗涤培养基。使用前需新鲜配制，将细胞密度调整为每毫升1×10⁶个细胞至饲养细胞中。操作时，轻柔地将4毫升细胞悬液转移至每份样品中。在第7天将培养板置于37摄氏度、5% CO2条件下充分孵育。CD40 B细胞可在第7天进行首次传代培养，此后每3至4天传代一次。用移液管轻轻吹打六孔12板中的成簇细胞，使其重悬于Resus溶液中，并将CD40 B细胞转移至50毫升离心管中。以1200转/分钟（相当于220.5×g）离心7分钟，使CD40 B细胞完全沉淀。用 CD40-B 洗涤培养基更换培养液，并测定 CD40 活化 B 细胞的细胞数量。将 CD40-B 细胞重悬于 CD40-B 培养基中，调整细胞密度至每毫升 1 × 10⁶ 个细胞。然后，向细胞悬液中补充新鲜的人白细胞介素-4（IL-4），终浓度为每毫升50单位，以及环孢素A，终浓度为0.63微克/毫升，以进行刺激。使用前一天制备的经照射的饲养细胞。当然，在使用前应立即在显微镜下检查经照射的饲养细胞是否贴壁。若为贴壁细胞，用PBS快速洗涤饲养细胞两次，一次用PBS，另一次用CD40 B洗涤培养基。然后每孔小心加入4毫升CD40 B悬浮液，调整细胞密度至每毫升1×10⁶个细胞，接种于6孔板的每个孔中。每3至4天传代一次，每周两次，连续重复操作，至培养第14天时获得高纯度的人CD40活化B细胞簇。此时，CD40 激活的 B 细胞表达共刺激分子，如 CD80、CD86、CD83 和 MHC 分子，以及所谓的淋巴结归巢三联分子：CD62L、CCR7 和 LFA-1，这些分子可在细胞生成过程中由 Fox 检测以进行故障排查。请参考本实验方案的文本版本。我们希望未来 CD40 激活的 B 细胞能够成为癌症免疫治疗的重要工具。祝您的实验顺利。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人CD40激活的B细胞的生成

在本视频中，我们演示了从小鼠C57BL/6脾细胞中分离并激活扩增B细胞的实验步骤，这些B细胞可作为模型抗原呈递细胞（APC）用于研究免疫应答的诱导。...

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本文描述了一种在脾脏B淋巴细胞的ex...

重组逆转录病毒的制备及B细胞感染

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本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。...

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

我们介绍一种从人体血液中循环的稀有B细胞出发，制备针对特定抗原的人源抗体的方法。该方法能够高效、快速地产生天然抗体，所获得的抗体可区分高度相似的抗原。...

从血液中稀有的抗原特异性B细胞高效制备具有区分能力的人源单克隆抗体

利用多步骤培养系统，我们报道了一种体外B细胞向浆细胞分化的模型。...

人正常记忆B细胞体外分化为长寿命浆细胞模型

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

学习从外周血单个核细胞体外生成人CD40激活B细胞的方法，利用CD40配体和白介素-4刺激培养。该技术可高效扩增具有抗原呈递功能的B细胞，适用于免疫学和自身免疫疾病研究。

人源CD40活化B细胞的制备

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