人源CD40活化B细胞的制备

大家好，我叫Alexander Shiku Van Hagen。我是科隆大学医院免疫学与移植免疫学实验室的成员。在本视频中，我们将向您展示如何从外周血单个核细胞诱导生成人CD40活化的B细胞。

我们实验室的主要研究兴趣之一是探讨B细胞不依赖抗体的功能。除了作为抗体产生细胞外，B细胞在生理条件下以及自身免疫性疾病中均发挥重要的抗原提呈细胞作用。活化后，B细胞可获得强大的抗原提呈能力和免疫刺激能力，尤其是通过CD40活化时。

CD40。与树突状细胞相比，活化的B细胞具有多种优势。即使是从癌症患者的小量外周血中，也能以相对较低的成本轻松扩增活化B细胞。

现在，我们的博士生Tanya Leic和实验员LER将为您逐步介绍如何从外周血中制备人CD40活化的B细胞。大家好，我叫Tanya Livi，是一名博士生，我将向您演示如何制备人CD40活化的B细胞。

该实验步骤已在我们的实验室中优化。主要步骤首先是制备饲养细胞。我们使用转染了人 CD40 配体的 NIH 3T3 细胞，经 78 Gy 照射后，接种至 6 孔板中。

其次，我们开始培养人CD40激活的B细胞，这些细胞来源于经纯化的外周血单个核细胞（PBMC），并用人类白细胞介素-4和环孢素A处理，随后将这些细胞接种到六孔板中的饲养细胞（fetal cells）上。该操作在第7天重复一次，之后每3至4天重复一次，直至细胞培养的第14天。为了获得高纯度的人CD40激活的B细胞，我们使用 freshly purified 或适当保存的人PBMC来启动CD40激活的B细胞的生成。

首先，我们将 PBMC 洗涤两次，即用 50 毫升 PBS 重悬细胞。在 1300 转/分钟（相当于 260 ×g）条件下离心 7 分钟。弃去上清液，再用 50 毫升 PBS 重悬细胞，并在 1100 转/分钟（相当于 190 ×g）条件下再次离心 7 分钟。再次弃去上清液，用于后续细胞计数的测定。

将PBMC重悬于20毫升PBS中，通过涡旋充分混匀细胞，并测定细胞数量。根据所需数量，以1200转/分钟（相当于220.5 ×g）离心5分钟收集用于CD40-B培养的PBMC。使用六孔板时，每孔需要4 × 10⁶个细胞，每块板共需24 × 10⁶个细胞。

然后将PBMC重悬于CD40-B培养基中，密度为每毫升1×10⁶个细胞。在细胞悬液中加入新鲜的人IL-4，终浓度为50单位/毫升，用于刺激；同时加入浓度为0.63 µg/mL的环孢素A，以抑制T细胞的生长。此时，PBMC悬液已准备好用于CD40配体的刺激。

据我们所知，目前尚无功能性GMP级SOMAL CD40配体可供使用。因此，我们采用转染了人CD40配体的NIH/3T3细胞来刺激细胞的存活、分化和增殖，因为NIH/3T3细胞系可在培养中存活数月。必须定期通过实验排除CD40配体表达的丢失情况。

CD40配体转染的NIH 3T3是一种贴壁细胞系，在含有0.7毫克/毫升G418的筛选培养基中，于37摄氏度、5% CO2条件下培养。该贴壁成纤维细胞系不应让其完全汇合，应每周传代两次。传代贴壁细胞时，吸除培养基，用10毫升PBS轻柔振荡洗涤一次，再次吸除液体，然后在75平方厘米培养瓶中加入4毫升胰蛋白酶-EDTA溶液。

将烧瓶放入培养箱中，在 37 度条件下孵育 5 至 10 分钟。再次取出烧瓶，轻轻敲击以使细胞从塑料表面脱落。

然后轻轻加入10毫升野生型培养基并轻柔混匀，将细胞转移至50毫升离心管中。以1200转/分钟（相当于125 × g）离心5分钟，沉淀NA83T3细胞。用10毫升野生型培养基小心重悬沉淀的细胞。

确定NIH 3T3亚培养物的细胞数量，并将1.5 × 10⁶个饲养细胞重悬于10毫升野生型培养基中。将其转移至75 cm²培养瓶中，并加入G418至终浓度为0.7 mg/mL，以筛选携带新霉素抗性基因的转染细胞。最后将饲养细胞置于37°C、5% CO₂条件下培养，用于CD40 B细胞刺激。

取剩余的NI 8 3 3细胞，用78 Gy剂量进行致死性照射，以阻止其增殖。将照射后的饲养细胞用wire type培养基稀释，细胞密度为0.1 × 10⁶ 个细胞/毫升，每孔加入2毫升，接种于6孔板中。将6孔板中的细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时，使其重新贴壁后，作为饲养细胞用于CD40配体刺激B淋巴细胞。

在显微镜下检查前一天接种的饲养细胞是否已贴壁。如果饲养细胞已经贴壁，移除每个孔中的SUP natin，并迅速洗涤两次：第一次用2毫升PBS洗涤每个孔，第二次用2毫升PBS洗涤。

用于PBMC悬液刺激的CD40B洗涤培养基。使用前需新鲜配制，将细胞密度调整为每毫升1×10⁶个细胞至饲养细胞中。操作时，轻柔地将4毫升细胞悬液转移至每份样品中。

在第7天将培养板置于37摄氏度、5% CO2条件下充分孵育。CD40 B细胞可在第7天进行首次传代培养，此后每3至4天传代一次。

用移液管轻轻吹打六孔12板中的成簇细胞，使其重悬于Resus溶液中，并将CD40 B细胞转移至50毫升离心管中。以1200转/分钟（相当于220.5×g）离心7分钟，使CD40 B细胞完全沉淀。

用 CD40-B 洗涤培养基更换培养液，并测定 CD40 活化 B 细胞的细胞数量。将 CD40-B 细胞重悬于 CD40-B 培养基中，调整细胞密度至每毫升 1 × 10⁶ 个细胞。

然后，向细胞悬液中补充新鲜的人白细胞介素-4（IL-4），终浓度为每毫升50单位，以及环孢素A，终浓度为0.63微克/毫升，以进行刺激。使用前一天制备的经照射的饲养细胞。当然，在使用前应立即在显微镜下检查经照射的饲养细胞是否贴壁。

若为贴壁细胞，用PBS快速洗涤饲养细胞两次，一次用PBS，另一次用CD40 B洗涤培养基。然后每孔小心加入4毫升CD40 B悬浮液，调整细胞密度至每毫升1×10⁶个细胞，接种于6孔板的每个孔中。每3至4天传代一次，每周两次，连续重复操作，至培养第14天时获得高纯度的人CD40活化B细胞簇。

此时，CD40 激活的 B 细胞表达共刺激分子，如 CD80、CD86、CD83 和 MHC 分子，以及所谓的淋巴结归巢三联分子：CD62L、CCR7 和 LFA-1，这些分子可在细胞生成过程中由 Fox 检测以进行故障排查。请参考本实验方案的文本版本。我们希望未来 CD40 激活的 B 细胞能够成为癌症免疫治疗的重要工具。

祝您的实验顺利。