利用鲎，Limulus Polyphemus，进行视觉研究

大家好，我是克里斯·帕格利亚（Chris Paglia），波士顿大学生物医学工程系视觉信息处理实验室的主任。我是刘佳琪（Jacque Liu），帕格利亚博士实验室的一名博士生。我们实验室的研究致力于理解使动物能够看见的神经计算机制。

在本项研究中，我们使用地球上最古老的生物之一——美洲鲎。这些动物可能是活化石，它们在生物医学研究中继续发挥着不可或缺的作用。

它们的血液不仅含有特殊的细胞，科学家可利用这些细胞来检测我们药物中的细菌毒素，而且它们的眼睛还包含一个神经网络，为研究人类视觉系统的运作机制提供了重要线索。光适应和侧向抑制等过程的细胞基础最初正是通过对这种动物的复眼进行研究而揭示的，由于这项开创性工作，Keffer Hartline 博士于1967年获得了诺贝尔奖。鲎至今仍是视觉研究中备受青睐的模型，因为作为无脊椎动物，它体型较大且生命力强，其视网膜神经元体积大且易于操作。

其视觉系统结构紧凑且被广泛研究，视觉行为也已明确界定。此外，动物大脑中的昼夜节律钟会每日调节其眼睛的结构与功能。简而言之，鲎的视觉系统足够简单以便理解，同时又足够复杂而具有研究价值。

在本视频中，我们将展示利用这一经典动物模型在体内开展的三种视觉神经机制研究的实验范式。对于视觉研究，这些方法包括视网膜电图记录、视神经记录和视网膜内记录。鲎被饲养在通风的海水水箱中，饲养房间内保持受控的明暗循环条件。

在开始任何这些记录技术之前，先将动物置于冰桶中冷却约10分钟，然后通过在前体节和EPI体节各插入两枚不锈钢螺丝，将其固定在木质平台上。平台底部配有花岗岩配重，使其能在水中下沉。视网膜电图（ERG）用于监测眼睛敏感性随时间的变化。

它测量眼睛中所有细胞的总体电反应。进行此实验所需的闪光刺激工具包括螺丝刀、凡士林、林格氏液、移液器、LED灯、记录室、不锈钢螺丝和棉签。我们使用自制的记录室来测量视网膜电图（ERG）。

该装置主体设计用于容纳与眼睛接触的生理盐水储液腔。盖子内含一根氯化银导线，用于将导电溶液连接至放大器，另有一个小孔，用于在安装前固定LED。腔室的底面涂有凡士林。

然后用两个充满盐水并加盖的螺丝将室固定在马蹄蟹的眼睛上。将动物置于一个不透光的笼子中，并放入充满海水的水箱内，使海水覆盖其鳃部。将LED电缆插入室盖中。

将信号导联夹在腔室导线上，参考导联夹在其中一个植入的螺丝上，两个导联均连接至高阻抗差分放大器的前置放大器，用于信号放大和噪声过滤。然后将屏蔽笼关闭，以防止室内光线照射到动物。前置放大器连接至放大器，并将放大器滤波器设置为仅通过约10赫兹以下的频率。

随后，信号被传送至示波器以供观察，并同时传送到数据采集板，用于计算机分析和存储。我们使用基于 LabVIEW 编写的自定义程序来控制 LED 输出光刺激，并记录视网膜电图（ERG）信号。LED 通过每 10 分钟一次、持续 100 毫秒、5 伏的脉冲触发。左侧显示每次闪光刺激对应的 ERG 波形，右侧则绘制了连续闪光波形的峰-峰振幅，用于追踪眼睛敏感度随时间的变化。

通过ERG记录，可以研究光适应和昼夜节律神经调制的影响。眼睛将视觉信息传递给大脑，并通过其视神经纤维产生动作电位反应。这些编码的信息可通过细胞外记录单根神经纤维来研究。

该方法还可用于研究昼夜节律钟信号对眼睛的反馈作用。本实验所需的工具包括螺丝刀、螺丝、任氏液、玻璃微电极拉制仪、剪刀、记录室、弯头镊子、细针探头、钝性解剖刀、手术剪以及记录电极。记录室设计有舌状结构以容纳神经，可向其中加入20毫升任氏液。可通过在蟹类铰链肌之间插入16号针头并通向心脏，从而从马蟹体内引流血液。

放血并非必需，但将动物固定在平台上进行放血可使视神经解剖操作更为容易。视神经的位置可通过在腕部的侧眼与中眼之间画一条轻微弯曲的线来估计。随后使用修形锉在腕部钻出一个圆形孔洞。

孔的直径与腔室底部相同。孔的中心位于侧眼前方约两厘米处，并略高于该水平线，以便神经沿腔室腹侧走行。将覆盖的结缔组织清除，直至整段神经清晰可见，并将暴露的神经从周围及下方组织中游离出来。将一根细线环绕神经，然后经由底部的半圆形开口拉入腔室内。

通过同一开口，轻拉细绳将神经缓缓引入腔室。当神经进入腔室时，将腔室底部推入孔中，以尽量减少对神经的牵拉。随后用两枚螺钉固定腔室，并加入任氏液。

安装腔室后，将动物置于充满海水的水箱中的浅水笼内，使海水覆盖其鳃部。在体视显微镜下观察腔室内部，并在底部开口周围垫入棉絮，以防止血液流入腔室以及任氏液外溢。随后用新鲜的任氏溶液重新充满腔室。

使用精细的弯剪和镊子去除残留组织。在包裹神经的鞘膜上做一小切口，用细针探针将神经从鞘膜中分离。沿神经长轴方向逐步剪开并剥离去除鞘膜。

然后使用探针从神经中分离出一根细小的纤维束，并在距离眼睛最远的一端切断，用于传入纤维记录；而对于传出纤维记录，则在靠近眼睛的一端切断。我们采用一个充满林格溶液的AM系统分区电极进行记录，该电极通过导管连接至吉尔森注射器以施加负压。电极尖端由火焰抛光制成，使用外径为1毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管（A和C连接）拉制而成，用于传导信号；参考电极则为缠绕在电极周围的氯化银丝，以降低噪声。

将电极尖端置于记录室中，并通过负压吸引将神经束的切断端吸入玻璃尖端内。信号电极和参考电极连接至差分放大器的前置放大级，用于信号放大和噪声滤除。放大器输出信号被传送至示波器以供观察，同时送入数据采集卡进行计算机分析和存储。

我们使用基于 LabVIEW 编写的自定义程序来控制光刺激，并使用数字脉冲鉴别器记录脉冲序列。采用光纤导光管对单个细胞进行照明，而通过计算机控制的视频显示器实现视神经记录的模式刺激，从而可以在眼内研究眼睛与大脑之间的信号传递。记录过程包括将微电极直接插入眼内的细胞，并记录由光诱导的细胞内电压波动。

本实验所需的工具包括螺丝刀、L 形透明平台。带螺纹的螺丝孔、玻璃电极上方的微型电极、不锈钢螺丝、镊子和精细的手术刀。在固定蟹体后，将一个稳固的支架、木质平台以及带有预设螺丝孔的透明板通过侧边两个螺丝和顶部一个螺丝固定在腕部。

将动物置于一个避光的笼子中，并放入充满海水的水箱内，使海水覆盖其鳃部。使用螺丝将电动显微操作器固定在刀片上，并将操作器的臂调整至眼睛上方。用外径为1毫米的硅酸盐玻璃管拉制一批玻璃微量移液管，并通过毛细作用将尖端回填。

将移液管置于含有3摩尔氯化钾溶液的小瓶中数分钟，即可手动用盐溶液充满移液管的其余部分，然后将其插入已预先充满溶液的微电极夹持器中，以防止气泡形成。随后将电极夹持器插入固定在显微操纵器上的细胞内放大器的前置电极头中。通过小心切除背部角膜的一小块方形区域，暴露视网膜的一部分。

用手术刀在暴露的组织上滴加一滴林格液，以防止组织干燥，然后将微移液管向视网膜推进。当移液管尖端接触溶液时，启动细胞内放大器的电流注入模式，并测量微移液管的电极阻抗；阻抗不在20至70兆欧范围内的微移液管将被弃用。阻抗在此范围内的微移液管则以微米级步进方式推进进入视网膜，并通过电子振动尖端刺入细胞，同时通过光纤管或视频显示器施加光刺激，以刺入对光刺激有反应的细胞。

在鲎的眼中可能遇到三种类型的细胞：ular细胞、偏心细胞和色素细胞。ular细胞对光产生强烈的去极化反应，偏心细胞则在去极化反应基础上表现出一连串的动作电位，而色素细胞则完全不产生光反应。这些反应可通过视网膜内记录在示波器上观察，并记录到计算机中。人们可以借此研究视觉的细胞基础。

总之，我们展示了如何在活体鲎上进行视网膜电图记录、视神经记录以及视网膜内记录。这些方法应用广泛，可为研究鲎视觉信息处理的神经机制提供独特的见解。这些技术不仅在科研实验室中易于实施，也可轻松整合到视觉神经生理学的教学实验中。

感谢观看，祝您的实验顺利。