大型插入环境基因组文库生产

大家好，我是来自不列颠哥伦比亚大学微生物学和免疫学系 Steven Helm 实验室的 Marcus to。今天，我们将向您展示构建大型插入环境库的程序。协助我进行今天的手术的是 San Lee，他将进行噬菌体包装和文库宿主 e 大肠杆菌的感染，以及 Elise Hawley 和 Chin Yang，他们将进行菌落挑选。

我们的实验室有这个程序来研究海洋和陆地环境中的微生物群落结构和代谢。那么让我们开始吧。该用于创建 fo smid DNA 文库的方案在从生物质样品中分离和剪切基因组 DNA 程序后开始，我们在随附的文章 Jo 中详细介绍了这些程序。

接下来的几个步骤制备 SHE DNA，以便连接到 SMID 载体 PCC one。第一步是修复 DNA 的 SHE 片段末端并磷酸化。五个引物末端，此步骤所需的所有试剂都包含在 PCC 一个 SMID 文库生产试剂盒中，用于设置末端修复反应，在冰上解冻所有试剂，然后混合末端修复缓冲液 DNTP，以每微升 0.5 微克的酶混合物和水混合多达 20 微克的 she 插入 DNA 以达到 80 微升，短暂离心试管以使所有液体进入底。

在室温下孵育末端修复反应物 45 分钟至一小时。然后加热，他在 70 摄氏度下灭活酶 10 分钟。在末端修复孵育期间，您可以为下一步准备凝胶。

脉冲场凝胶电泳或 PFGE，您的目标是分离 30 到 60 个 DNA 分子。千碱基 PFGE 是一种电泳方法，用于分离这些在标准电泳过程中一起运行的大片段。首先，使用 150 毫升一种 XTAE 电泳缓冲液中的低熔点制备 1% 凝胶。

选择能够将整个 80 μL 末端修复 DNA 样品和上样缓冲液上样到一个或两个孔中的电泳梳。作为低熔点 agros 凝胶处理凝胶时要特别小心。凝胶凝固时很容易破裂。

准备电泳室。将 2.2 升 1 XTAE 加入腔室中，然后打开机器以循环运行缓冲液。将冷却装置设置为 14 摄氏度，并将泵设置为 70 RPM。

包括一个同样来自 NEB 的中档 1 PFG 标记。为避免将凝胶切割得太高，请从凝胶注射器中挤出凝胶，然后用手术刀从末端切出一个小塞子。将塞子放在孔的前面，并用熔融的 aros 密封。

在上样凝胶之前，确保电泳缓冲液已冷却至 14 °C。在第一口井中，加载 5 微升 New England Biolabs Lambda 印地语 3 消化物。在第二个孔中，加载 1 微升 Smid 对照大小标记物，用 10 微升无菌水和上样缓冲液稀释。

然后加载修复并热灭活的混合物和加载缓冲液。合上盖子并对机器进行编程。凝胶将运行过夜或 12 小时。

凝胶电泳完成后，使用网络金染色剂观察 DNA，稀释网络金。在 250 毫升 1 XTAE 中，将凝胶放入溶液中，在黑暗中染色 1 小时Cyberg gold 对光敏感 凝胶染色时。准备一个 70 摄氏度和一个 F 45 摄氏度的水浴，用于接下来的凝胶提取步骤。

下一步是切除和凝胶。纯化 DNA 大小范围为 30 至 60 kb。将染色的凝胶与空的撕裂和标记的微型诡计管和无菌手术刀一起带到蓝光透射器中。

在透射光器上铺上保鲜膜，以避免交叉污染凝胶。打开观察眼镜并打开蓝光。现在您可以看到末端修复的基因组 DNA 和 FO smid 对照大小标记 用手术刀切除 5 到 7 毫米宽的凝胶切片，该凝胶切片与 smid 对照大小标记一起迁移并略高于 smid 对照大小标记。

使用 PFG 标记作为切片的上限。将切片转移到撕裂的管子上。您可以在零下 20 摄氏度下存放切片长达一年，然后再继续。

现在是时候凝胶了。从切片中纯化 DNA。称量装有凝胶切片的试管，并通过减去撕裂重量来计算切片的重量。

接下来，将切片在 70 摄氏度的水浴中融化 10 到 15 分钟。凝胶切片完全融化后，将试管快速转移到 45 摄氏度的水浴中。请记住，一毫克固体凝胶在熔化后的体积为 1 微升。

每 100 微升融化的 aros 添加 1 单位或 1 微升 Jase 酶制剂。在 45 摄氏度下孵育 1 小时。然后再加入 2 到 4 微升 les，并在 45 摄氏度下再孵育 1 小时。

加热后在 70 摄氏度下灭活凝胶 10 分钟。灭活酶，将试管置于冰上 10 分钟，然后以最大速度离心。13， 000 RPM 沉淀 15 分钟，以沉淀任何不溶性颗粒。

小心不要打扰颗粒。去除含有纯化 DNA 的上层上清液，并将其转移到 15 mL Falcon 管中。然后用 3 毫升无菌水进行稀释，然后洗涤和浓缩 DNA。

将溶液从 15 mL Falcon 管转移到带有 ultra cell 10 膜的 Ancon Ultra 四离心过滤装置中。使用 50 mL（猎鹰管）作为适配器，将过滤装置置于水平桶转子中，以 4， 000 GS 离心 6 至 8 分钟。离心至约 100 至 500 微升溶液。

留在过滤器上并丢弃流出物。然后将另外 3 毫升无菌水加入空的猎鹰管中。将溶液转移到 Amon 管中并重复离心步骤。

第三次清洗 falcon 管，并将过滤器上收集的最终体积减少到 50 至 100 微升。您无需担心丢失样品。即使在长时间离心后，过滤器仍可保留 50 μL 液体。

将剩余的 DNA 溶液从 AmCon 管转移到预洗的 MicroCon YM 50 离心过滤装置中，并用额外的 50 μL 无菌水冲洗 Amon 管，以回收所有 DNA 离心机。MicroCon YM 50 离心过滤器装置在微量离心机中以 10， 000 GS 的速度离心，直到过滤器仍略微被液体覆盖。每分钟检查一次。

如果过滤器上只剩下少量液体。将过滤器倒置，在新鲜的微量离心管中以 1000 GS 的浓度离心 3 分钟，进行第二次离心步骤，回收 DNA 溶液。所得体积总量不应超过 10 至 15 微升。

否则，您的 DNA 可能太稀而无法进行连接。通过 NanoDrop 或 Pico Green 检测检查所得 DNA 溶液的浓度。恢复和修复。

DNA 现在已准备好连接到 PCC 上，一个 FO SMID 克隆载体用于连接，在冰上解冻所有试剂。然后按照此处列出的顺序混合，每次添加后混合。首先，加入无菌水以达到 10 μL 的反应体积。

然后 10 x 快速连接缓冲液、10 毫摩尔 A-T-P-P-C-C 一个 SMID 载体，并以 10：1 的摩尔比插入。最后是快速连接 DNA 连接酶。短暂离心试管，使所有液体到达底部。

轻敲管子并再次旋转。在室温下孵育连接反应物 2 小时，并在 70 摄氏度下加热灭活酶 10 分钟。此时，您可以将连接反应物储存在零下 20 摄氏度，也可以进行噬菌体包装步骤。

下一步是生成细菌噬菌体，这些噬菌体将在您计划进行噬菌体包装步骤前两三天将您的 FO SMID 文库引入大肠杆菌中，将提供的 EPI 300 T 单抗接种菌株在普通 LB 板上划线，并在 37 至摄氏度下孵育过夜以获得单个菌落。您可以密封此板并将其存放在 4 摄氏度以备将来使用。在包装反应的前一天，接种 50 毫升 Albee 肉汤加 10 毫摩尔硫酸镁，以及来自 Epi 300 板的单个菌落，以 225 RPM 和 37 摄氏度摇动过夜。

包装反应当天，接种新鲜的 50 毫升 LB 肉汤和 10 毫摩尔硫酸镁和 5 毫升过夜培养物。培养，细菌在 37 摄氏度下达到 OD 600 为 0.8 至 1.0。不要超过 OD 600 的 1.0。

在分光光度计上测量之前稀释样品，以获得准确的结果。储存在冰上或 4 摄氏度，直到您准备好继续或最多 72 小时。现在细菌已经准备好进行感染，是时候准备噬菌体解冻了。

Lambda Packaging 在冰上提取的最大斑块。每个连接反应使用一根试管，解冻大约需要 10 到 15 分钟。同时，将 1.5 mL 空试管再次置于冰上预冷，每个反应使用一根试管。

Lambda 包装提取物解冻后，立即将每种包装提取物转移到预冷的 1.5 mL 微量离心管中，并置于冰上。将剩余的包装提取物返回至零下 80 摄氏度。将解冻的包装提取物在冰上放置太久会降低感染效率。

接下来，在冰上向每 25 微升解冻的提取物中加入 10 微升的连接反应物，通过移液溶液数次而不引入气泡进行混合。短暂离心以巩固试管底部的所有液体，并在 30 摄氏度的水浴中孵育包装反应 90 分钟。孵育 80 分钟后，在冰上解冻剩余的包装提取物。

90 分钟包装反应完成后，将剩余的 25 μL 包装提取物添加到每个反应管中。在 30 摄氏度下再孵育反应 90 分钟。第二次孵育后，在每个包装管中加入 100 μL 制备好的噬菌体稀释缓冲液，并轻轻混合，向每个管中加入 5 μL 氯仿。

现在，试管中的总体积应为 165 μL。氯仿后可形成粘稠沉淀。移液噬菌体颗粒时，请避免这种沉淀物以及有机氯仿相。

此时，如有必要，您可以将包装好的噬菌体颗粒在 4 度下储存数天，但使用新鲜制备的噬菌体以获得最佳效果。现在，您可以感染宿主细胞，这些细胞在整个噬菌体包装步骤中一直在生长。以每 10 微升噬菌体颗粒对 400 微升 epi 300 T one 耐药细胞的比例，将包装的噬菌体添加到 OD 600.8 至 1.0 的 EPI 300 T one 抗性宿主细胞中。

为避免从包装噬菌体试管底部移出任何氯仿，我们使用 125 微升包装的噬菌体颗粒和 5 毫升制备的 epi 300 T 单抗性宿主细胞轻轻混合，然后在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。下一步是确定包装噬菌体的滴度。您可以通过将受感染的细菌接种在培养基上以选择受感染的细胞来实现这一点。

然后计算所得菌落并除以添加到您铺板的细菌中的噬菌体体积。C one SMID 包含一个氯霉素耐药基因。因此，为了选择受感染的克隆，将细菌铺在含有 LB 的氯霉素平板上。

将 2 倍 50 微升和两倍 10 微升的噬菌体感染的 EPI 300 T 1 抗性细胞铺布在四个单独的板上，并将板倒置在 37 摄氏度的培养箱中 16 至 24 小时，不超过 48 小时，直到形成菌落。同时，通过在 4 摄氏度下以 3， 500 GS 离心 10 分钟，从 5 毫升感染中收获残留的 EPI 300 T 一抗性细胞。丢弃上清液。

将 1 毫升含 20% 甘油的 LB 添加到试管复苏器中。将细胞沉淀和季铵盐分别悬浮在两毫升冷冻管中，各 100 微升，立即冷冻并在零下 80 摄氏度下储存。为了在第二天的菌落挑选步骤中进一步使用，请在 37 摄氏度培养箱中计算四个平板上的克隆数量，并确定包装噬菌体的滴度，供您在下一步中使用。

冷冻的 EPI 300 T 单抗甘油储备液包含用文库中所有不同质粒转导的细胞。接下来，根据每个 smid 的病毒滴度和平板大小铺布适量。在 2 45 x 2 45 毫米的正方形上克隆。

使用玻璃珠的氯霉素 LB 生物测定板。还要在板中加入少量 LB 肉汤，以均匀分布细胞。请记住，制备甘油原液还会使您的细胞浓缩约五倍。

在菌落采摘的日子里，在 37 摄氏度下孵育 24 小时，准备 96 或 3 个 84 孔板，每孔填充 200 微升或 70 微升 LB 肉汤。每毫升肉汤中添加 12.5 微克氯霉素用于抗生素选择，10% 甘油用于冷冻。我们在此步骤中使用自动 QFI 三板填充系统。

下一步是从准备好的 LB CHLORAMPHENICOL 板中挑选菌落，放入准备好的 96 或 3 84 孔板中进行冷冻。在此步骤中，根据用户手册，我们使用克隆挑选机器人 qix two，在克隆挑选区域周围创建一个无菌环境。在紫外线灯打开时打开 UV 灯 30 分钟。

准备 500 毫升 1% 漂白剂、500 毫升无菌去离子水和 500 毫升 80% 乙醇。当紫外线灯关闭时，按照从后到前的标签装满托盘。在前托盘中加入 1% 漂白剂，然后高压灭菌去离子水和 80% 乙醇。

确保它们已装满，因为如果没有足够的清洗液，就无法正确清洗采摘针。设置最佳挑取参数后，取下细菌板和装满 LB 的 96 或 3 84 孔板的盖子，并将它们放置在 Q 挑取的柱之间。工作区域板应紧贴右前角，以免它们在拾取过程中移动。

然后关闭前面板。设置完所有参数后，就可以开始领料程序了。所有拣选完成后，用去离子水冲洗刷子和托盘，然后放在工作台上晾干。

清理可能发生的任何溢出物，并用 80% 乙醇擦拭 CICS 内部。确保所有甘油储备板都已标记，并将它们置于 37 摄氏度的培养箱中 24 小时，以便从每个挑选的菌落中培养出培养物。在培养箱上留下一张纸条，其中包含孵育板的日期、编号、孵育时间、取出时间和您的姓名首字母。

孵化后，您就有了自己的文库。每个孔都包含一个细菌克隆的培养物，其中含有 PCC，一个 fo smid 连接到起始样品中的一段透明 DNA。将盘子在零下 80 摄氏度下冷冻以进行长期储存，并祝贺自己做得很好。

所提出的协议描述了如何生成环境 smid 文库以捕获给定栖息地中微生物群落的遗传内容的过程。该协议应创建一个 SMID 库，该库代表采样环境的遗传内容，并应使读者能够优化关键步骤。如果在整个过程结束时获得的 FO smid 克隆量太低。

我们刚刚向您展示了如何从海水样本中提取的基因组 DNA 构建 FO SMID 文库。在进行此过程时，重要的是从高质量的基因组 DNA 开始。在开始之前，请准备好所有板和试剂，并为这个多步骤过程计划足够的时间。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。