大型插入片段环境基因组文库构建

大家好，我是来自不列颠哥伦比亚大学微生物学与免疫学系Steven Helm实验室的Marcus To。今天我们将向您展示构建一个大插入片段环境文库的实验流程。在今天的实验中协助我的有San Lee，他将负责噬菌体的包装以及文库宿主大肠杆菌的感染操作；此外还有Elise Hawley和Chin Yang，他们将进行菌落挑取。

我们实验室采用此方法研究海洋和陆地环境中微生物群落结构及其代谢活动。现在让我们开始吧。本方案用于构建fosmid DNA文库，其步骤始于生物量样品中基因组DNA的分离与剪切，相关操作已在配套的JoVE文章中详细说明。

接下来的几个步骤将对SHE DNA进行处理，以便连接到SMID载体PCC one中。第一步是修复SHE DNA片段的末端并进行磷酸化。5′末端修复所需的所有试剂均包含在Epicenter公司提供的PCC one SMID文库构建试剂盒中。进行末端修复反应时，将所有试剂在冰上解冻，然后依次加入末端修复缓冲液、dNTP混合物、ATP，以及浓度为每微升0.5微克、总量不超过20微克的SHE插入DNA，再加入酶混合物和水，最终反应体系体积为80微升。短暂离心以确保所有液体沉降至管底。

将末端修复反应在室温下孵育45分钟至1小时。然后在70摄氏度加热10分钟以灭活酶。在末端修复孵育期间，可准备下一步所需的凝胶。

脉冲场凝胶电泳（PFGE）的目标是分离大小在30至60千碱基对之间的DNA分子。PFGE是一种电泳方法，用于分辨这些在标准电泳中会共同迁移的大片段DNA。首先，使用低熔点琼脂糖在150毫升1×TAE电泳缓冲液中制备1%的凝胶。

选择能够将末端修复的DNA与上样缓冲液混合后的80微升样品全部加载到一个或两个孔中的梳子。在处理低熔点琼脂糖凝胶时需格外小心，因为凝胶在凝固过程中极易破碎。

准备电泳槽。向槽中加入 2.2 升 XTAE 缓冲液，并开启设备以循环运行缓冲液。将冷却装置设置为 14 摄氏度，泵速设置为 70 转/分钟。

同时加入一个来自NEB的中等大小范围的PFG标记物。为避免切胶位置过高，从胶注射器中挤出少量琼脂糖，并用解剖刀从末端切下一小块凝胶块。将该凝胶块置于加样孔前端，并用熔化的琼脂糖密封。

在上样前，确保电泳缓冲液已冷却至14摄氏度。在第一孔中加入5 µL的New England Biolabs Lambda HindIII DNA消化产物。在第二孔中加入1 µL的Smid对照大小标记物，该标记物用10 µL无菌水稀释并加入上样缓冲液。

然后加入末端修复并热灭活的混合物以及上样缓冲液。盖上盖子并设置仪器程序，凝胶将运行过夜或12小时。

当凝胶电泳完成后，使用Cyber Gold染色剂对DNA进行染色。将Cyber Gold在250毫升1×TAE缓冲液中稀释，将凝胶放入该溶液中，在避光条件下染色1小时（Cyber Gold对光敏感）。在凝胶染色的同时，准备一个70摄氏度和一个45摄氏度的水浴，用于后续的凝胶回收步骤。

下一步是切胶并进行纯化。从凝胶中切下目标大小范围为30至60千碱基对的DNA条带，并进行纯化。将染色后的凝胶与一个空的、已撕开并标记好的微量离心管以及一把无菌手术刀一同带到蓝光透射仪上操作。

用塑料膜覆盖透照仪，以避免凝胶交叉污染。戴上观察眼镜，打开蓝光灯。此时可观察到末端修复的基因组DNA以及FO smid对照大小标记物。使用解剖刀切取一块宽度为5至7毫米的凝胶条带，该条带的迁移位置应与smid对照大小标记物齐平或略高。

使用PFG标记作为切片的上界。将切片转移至撕开的试管中。在继续实验前，切片可在-20摄氏度下保存长达一年。

现在开始进行凝胶回收。从切下的胶块中纯化DNA。称量含有胶块的离心管重量，通过减去空管重量计算出胶块的净重。

接下来，将凝胶块置于70摄氏度水浴中熔化10至15分钟。当凝胶块完全熔化后，迅速将离心管转移至45摄氏度水浴中。注意，1毫克固体凝胶熔化后的体积为1微升。

每 100 微升融化的 aros 中加入一单位或一微升 Jase 酶制剂。在 45 摄氏度下孵育一小时。然后额外加入两到四微升 les，在 45 摄氏度下再加热孵育一小时。

加热后，在70摄氏度下使凝胶失活10分钟。使酶失活后，将试管置于冰上10分钟，然后以13,000 RPM的转速离心15分钟，以沉淀任何不溶性颗粒。

小心操作，避免扰动沉淀。移除含有纯化DNA的上清液，并将其转移至一个15毫升离心管中。然后加入3毫升无菌水，以洗涤和浓缩DNA。

将溶液从15毫升Falcon离心管转移至带有Ultra cell 10膜的Ancon Ultra四联离心滤过装置中。将滤过装置放入摆桶转子，使用50毫升Falcon离心管作为适配器，于4,000 ×g条件下离心6至8分钟。离心至溶液剩余约100至500微升为止。

留在滤膜上，弃去滤过液。然后向空的离心管中加入另外三毫升无菌水。将溶液转移至Amon管中，并重复离心步骤。

第三次清洗 Falcon 管，并将滤膜上收集的最终体积浓缩至 50 至 100 微升。无需担心样品损失。即使经过长时间离心，滤膜仍会保留 50 微升液体。

将AmCon管中剩余的DNA溶液转移至预先清洗过的MicroCon YM 50离心过滤装置中，并用额外的50微升无菌水冲洗Amon管，以回收全部DNA溶液。将MicroCon YM 50离心过滤装置置于微量离心机中，在10,000 ×g条件下离心，直至滤膜表面仍轻微覆盖有液体为止。每分钟检查一次。

如果滤膜上仅残留少量液体，将滤膜倒置，并将滤膜放入新的微量离心管中，在1000 ×g 条件下离心3分钟，以回收DNA溶液。最终所得体积总计不应超过10至15 µL。

否则，DNA 可能过于稀释而不适用于连接反应。通过 NanoDrop 或 Pico Green 法检测所得 DNA 溶液的浓度。回收并修复。

现在可以将DNA连接至PCC one FO SMID克隆载体中。进行连接反应时，所有试剂均需在冰上解冻，然后按此处列出的顺序依次加入，并在每次添加后充分混匀。首先加入无菌水，以达到10微升的反应体系体积。

然后加入10倍快速连接缓冲液、10毫摩尔ATP-PC-C单链SMID载体和插入片段，摩尔比为10:1，最后加入快速DNA连接酶。短暂离心试管，使所有液体沉至管底。

轻弹管壁，再次离心。将连接反应在室温下孵育2小时，然后在70摄氏度下加热10分钟以灭活酶。此时，可将连接反应产物于-20摄氏度保存，或直接进行噬菌体包装步骤。

下一步是制备噬菌体，用于将您的 FO SMID 文库导入大肠杆菌。在计划进行噬菌体包装步骤前两到三天，将提供的 EPI 300 T1 抗性涂布菌株划线接种于普通 LB 平板上，并在 37°C 下培养过夜，以获得单菌落。您可以将该平板密封后于 4°C 保存，以备后续使用。在进行包装反应的前一天，用来自 Epi 300 平板的一个单菌落接种 50 毫升 LB 液体培养基（含 10 毫摩尔/升硫酸镁），在 37°C、225 转/分钟条件下振荡培养过夜。

进行包装反应当天，将5毫升过夜培养物接种于50毫升含10毫摩尔硫酸镁的新鲜LB液体培养基中。在37摄氏度培养细菌，使其OD600达到0.8至1.0。OD600不得超过1.0。

在分光光度计上测量前，请先稀释样品，以获得准确的结果。将样品置于冰上或4°C保存，直至准备进行下一步操作，最长可保存72小时。现在细菌已准备好用于感染，接下来需要准备噬菌体的解冻。

将 max plaques Lambda 包装提取物置于冰上融化。每个连接反应使用一支试管，融化过程大约需要 10 到 15 分钟。同时，再次在冰上预冷一支空的 1.5 毫升离心管，每个反应使用一支试管。

Lambda 包装提取物解冻后，应立即取 25 微升每种包装提取物转移至预冷的 1.5 毫升微量离心管中，并置于冰上。剩余的包装提取物需立即放回 -80 摄氏度保存。解冻后的包装提取物在冰上放置过久会降低感染效率。

接下来，将连接反应产物各10微升加入到预冷的25微升提取物中，置于冰上，用移液器轻轻吹打数次混匀，避免产生气泡。短暂离心，使管壁上的液体全部汇集至管底，然后将包装反应体系置于30°C水浴中孵育90分钟。在孵育80分钟后，将剩余的包装提取物置于冰上解冻。

90分钟的包装反应完成后，向每个反应管中加入剩余的25微升包装提取物。在30摄氏度下继续孵育反应90分钟。第二次孵育结束后，向每个包装管中加入100微升制备好的噬菌体稀释缓冲液，轻轻混匀，然后向每管中加入5微升氯仿。

此时，管中的总体积应为 165 微升。加入氯仿后可能会形成黏稠的沉淀物。用移液器吸取噬菌体颗粒时，应避免接触该沉淀物以及有机氯仿相。

此时，如有必要，可将包装好的噬菌体颗粒在4℃保存数天，但为获得最佳效果，建议使用新鲜制备的噬菌体。现在可以开始感染宿主细胞，这些宿主细胞（EPI 300 T1抗性细胞）已在噬菌体包装步骤期间持续培养。将包装好的噬菌体按每10微升噬菌体颗粒加入400微升EPI 300 T1抗性细胞（OD600为0.8至1.0）的比例加入宿主细胞中。

为避免从包装好的噬菌体管底部移取氯仿，我们取125微升包装好的噬菌体颗粒与5毫升已制备的对T1具有抗性的Epi 300宿主细胞轻轻混合，然后在37摄氏度下孵育30分钟。下一步是测定包装噬菌体的滴度。可通过将感染的细菌涂布于选择性培养基上以筛选感染细胞来完成。

然后计数获得的菌落，并除以接种到细菌中的噬菌体体积。C1 SMID 含有氯霉素抗性基因，因此为了筛选被感染的克隆，需将细菌涂布于含有氯霉素的 LB 平板上。

将噬菌体感染的 EPI 300 T1 抗性细胞分别取 50 微升两次和 10 微升两次，涂布于四个独立的平板上，将平板倒置于 37°C 培养箱中培养 16 至 24 小时，最长不超过 48 小时，直至菌落形成。同时，通过在 4°C 条件下以 3,500 ×g 离心 10 分钟，收集 5 毫升感染液中剩余的 EPI 300 T1 抗性细胞。弃去上清液。

向离心管中加入1毫升含20%甘油的LB培养基，重悬细胞沉淀，将悬液按每管100微升分装至2毫升冻存管中，立即冷冻并保存于-80摄氏度。若需在次日进行菌落挑取步骤，请在37摄氏度培养箱中计数四个平板上的克隆数量，并确定包装后噬菌体的滴度，该滴度将在下一步中使用。

冻存的 EPI 300 T 一抗性甘油菌株含有经文库中所有不同质粒转导的细胞。接下来，根据病毒滴度和每种质粒的培养皿大小，将适量的菌液涂布于 2.45 × 2.45 厘米的方形平板上进行克隆。

使用玻璃珠的含氯霉素LB生物测定平板。同时向平板中加入少量LB肉汤，以均匀分散细胞。需要注意的是，制备甘油菌种时还会使细胞浓度大约增加五倍。

在挑取菌落的当天，于37摄氏度孵育24小时，准备96孔板或3个84孔板，每孔分别加入200微升或70微升LB液体培养基，其中添加12.5微克/毫升氯霉素用于抗生素筛选，并添加10%甘油用于冷冻保存。此步骤我们使用自动化的qfi three板填充系统完成。

下一步是从已准备好的 LB 氯霉素平板中挑取菌落，转入已准备好的 96 孔或 384 孔板中用于冻存。在此步骤中，我们根据用户手册使用克隆挑取机器人 qix two，在克隆挑取区域周围创建无菌环境。开启紫外灯 30 分钟，在紫外灯开启期间进行操作。

准备 500 毫升 1% 次氯酸钠溶液、500 毫升无菌去离子水和 500 毫升 80% 乙醇。当紫外灯关闭后，按照从后到前的顺序将液体加入指定的托盘中。依次在后部托盘中加入 1% 次氯酸钠溶液、经高压灭菌的去离子水，以及前部托盘中的 80% 乙醇。

确保洗脱液充足，因为移液针在没有足够洗脱液的情况下无法彻底清洗。设置好最佳挑选参数后，取下细菌平板以及装有LB培养基的96孔或384孔板的盖子，并将其放置在Q picks的支架之间。工作区域的平板应紧靠前右角，以确保在挑选过程中不会移动。

然后关闭前面板。所有参数设置完毕后，即可开始挑选操作。全部挑选完成后，用去离子水冲洗刷子和托盘，并将其置于实验台上晾干。

清理任何可能发生的溢出物，并用80%乙醇擦拭CICS内部。确保所有甘油菌种保存板均已标记标签，并将其放入37摄氏度培养箱中培养24小时，以使每个挑取的菌落生长出培养物。在培养箱上留下一张记录纸条，注明培养的日期、培养板数量、培养开始时间、取出时间以及您的姓名首字母。

孵育结束后，您就获得了文库。每个孔中含有一个细菌克隆的培养物，该克隆包含一个PCC质粒，其上连接了来自起始样品的一段随机剪切的DNA片段。将平板置于-80°C条件下长期保存，并祝贺您圆满完成实验工作。

本方案描述了如何构建环境SMID文库，以捕获特定生境中微生物群落的遗传信息。该方案应能构建出能够代表所采样环境遗传内容的SMID文库，并帮助读者优化关键步骤。如果在整个流程结束时获得的FO smid克隆数量过少。

我们刚刚向您展示了如何利用来自海水样本的基因组DNA构建FO SMID文库。进行此操作时，务必使用高质量的基因组DNA作为起始材料。在开始实验前，应准备好所有培养板和试剂，并为这一多步骤流程预留充足的时间。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。