Name: 小动物的肌肉植入动态跟踪在体内荧光成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学习使用体内荧光成像技术监测小鼠肌肉再生过程的方法。本方案利用GFP标记的成肌细胞移植，实现纵向追踪细胞动态，为再生医学研究提供可靠的实时观察手段。

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杨Z和王Y的研究工作得到了NIAMS/NIH资助K02 AR051181、肌萎缩症协会以及哈佛干细胞研究所对王Y的资助支持。曾Q和徐X的研究工作得到了布里格姆妇女医院光学成像实验室获得的项目资助支持。作者感谢布里格姆妇女医院麻醉科刘W在细胞实验技术方面的帮助。

细胞制备
<ol>
 <li>卫星细胞分离 
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>在麻醉状态下，取 GFP 转基因小鼠（C57BL/6J-Tg-βactin-EGFP）的肢体肌肉组织。将肌肉切成小块后，加入 2% dispase 胶原酶溶液，于 37°C 孵育 1 小时，通过酶解法分离卫星细胞。 </li>
 <li>用含Ham F-10和20% FBS的生长培养基中和酶消化反应，通过反复吹打Pasteur移液管解离肌肉组织。细胞经细胞滤网（ø70-100μm）过滤后，接种于未包被培养皿中，在37°C孵育1小时。</li>
 <li>轻轻吸去上清液，将细胞接种至胶原包被的培养皿中。1小时后重复此步骤，以纯化成肌细胞。（预铺板）</li>
 <li>及时更换培养基并接种细胞。最终纯化的成肌细胞在含有Ham F-10、20% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素（生长培养基）的培养基中，于37°C、5% CO2和95%空气条件下培养。 </li>
 </ol> 
</li>
<li>在添加了10 ng/ml基础成纤维细胞生长因子（bFGF）的生长培养基中培养并扩增原代成肌细胞。</li>
<li>对于所有 体内 实验中，我们注射 5x105 每块TA肌肉的细胞数 </li>
<li>收获成肌细胞时，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA将细胞消化解离，并用PBS洗涤两次。用血细胞计数板计数细胞数量，然后将细胞重悬于HBSS中，浓度为5×10⁶个/mL。4 细胞/μl。收集后1小时内将HBSS中的浓缩细胞置于冰上并进行注射。</li>
</ol>
体内 成像
<ol>
<li>从杰克逊实验室购买4至6周龄的雄性mdx小鼠，并在动物饲养设施中进行维持。</li>
<li>经过约一周的环境适应后，小鼠即可接受培养细胞的移植。</li>
<li>在细胞移植前，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的混合物使小鼠麻醉。随后，在腿部涂抹Nair去除胫前肌区域的毛发，等待30秒后用蒸馏水擦拭干净。</li>
<li>在小鼠仍处于麻醉状态下，注入5x105 使用30号针头，将10μl HBSS中的细胞缓慢注射到每侧TA肌的3个位点。</li>
<li>在第4步之后，可以对小鼠进行常规成像 体内 荧光成像。使用配备高灵敏度电荷耦合相机的NightOwl LB981荧光成像系统（Berthold Technologies, Inc.）获取小鼠后肢的荧光图像。</li>
<li>在当天 体内 成像前，我们首先检查TA肌肉区域的毛发再生情况。如有必要，在用氯胺酮和赛拉嗪混合物麻醉小鼠后，按照上述方法重新涂抹Nair去除毛发。</li>
<li>在小鼠处于麻醉状态时，将其俯卧于一张黑色非荧光纸（Strathmore 公司的黑色 Artagain 纸）上。为充分暴露胫骨前肌以利于成像，用胶带将后肢足掌固定于纸上。 </li>
<li>将小鼠放入成像室，使待成像的后肢位于相机视野中心。首先更换发射滤光片，以5秒曝光时间拍摄后肢的传统灰度照片。如有必要，重新调整小鼠位置和相机焦距。实验过程中保持成像参数恒定，包括曝光时间（1,250 ms）、样品高度（0.9 cm）等。</li>
<li>然后切换至适合绿色荧光蛋白波长的发射滤光片。以1,250 ms的曝光时间和1×1的像素合并模式采集荧光图像。成像完成后，将小鼠从成像室取出并放入饲养笼中等待恢复。 </li>
<li>为进行分析，我们在荧光信号上绘制感兴趣区域（ROI），以测量其强度，单位为每秒光子数。同时，我们还测量ROI的像素数量，作为另一量化指标。若需获取纵向数据，成像实验可每周或更频繁地重复进行，持续数月。 </li>
</ol>
实验结束后，处死小鼠并取胫骨前肌进行组织学分析。

<ol><li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li>
<li>Green, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li>
<li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li>
<li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li>
<li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 Forthcoming.</li>
<li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci+Vis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li>
<li>In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li>
<li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+I.+A+histological%2C+morphometric+and+biochemical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li>
<li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li>
<li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li>
<li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li>
<li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li>
<li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells%2C+bone+marrow+cells%2C+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li>
<li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient%2C+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li>
</ol>

本研究建立了一个可靠且稳定的成像平台，用于在宿主骨骼肌中追踪荧光标记的移植细胞。来自绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠的GFP标记成肌细胞代表一类成体干细胞，未来有望成为细胞治疗的候选细胞。为获得高质量图像，尤其是进行定量分析，保持细胞数量、细胞注射、背景清晰度、成像位置及仪器参数的一致性操作至关重要。
荧光成像在生物医学研究中具有多种应用，因其具有非侵入性、操作简便以及高通量的优点。此外，荧光成像还可基于光子计数提供定量测量，但由于光在组织中会发生散射、衰减和吸收，难以穿透较深的组织，这是该技术的局限性之一。目前已有研究致力于采用红色或近红外报告分子以增加光的穿透深度。
荧光成像的另一个优势在于，如果特定的荧光报告分子获得用于人体的批准，该技术可直接转化应用于临床。与磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和正电子发射断层扫描（PET）相比，荧光成像具有更高的灵活性，因为它不需要昂贵的硬件设备和成像试剂。一个典型的例子是基于荧光的内窥镜和微内窥镜，这些设备已在临床中得到应用。通过将荧光成像与其他成像模式相结合，我们有望同时获取有关基础生物学过程的解剖和功能信息。

<table><tbody><tr><td>NightOwl LB981</td><td>贝托克技术公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在小型动物中追踪肌肉移植动态 在体 内 荧光成像

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

肌营养不良症是一组以进行性丧失收缩性肌细胞为特征的变性肌病。目前尚无治愈性治疗方法。干细胞生物学领域的最新进展为开发有效的细胞治疗手段以治疗这些疾病带来了新的希望。将用荧光蛋白标记的各种类型干细胞移植到肌营养不良动物模型的肌肉中，已在该领域得到广泛应用。一种能够纵向追踪移植细胞命运的非侵入性技术，可进一步提高我们对移植细胞肌肉植入效果进行更准确、更高效评估的能力。
在本研究中，我们证明了 体内 荧光成像是一种灵敏且可靠的方法，可用于追踪移植到小鼠骨骼肌中的GFP（绿色荧光蛋白）标记细胞。尽管使用外部激发光可能引起背景信号的担忧，但我们发现，通过使用裸鼠或使用脱毛试剂去除毛发，可显著减轻这一问题。利用CCD相机，在向胫骨前肌（TA）注射5 x 105 来自GFP转基因小鼠或eGFP转导的成肌细胞培养物的细胞。对于趾长伸肌（extensor digitorum longus, EDL）等较表浅的肌肉，注射较少数量的细胞即可产生可检测的信号。信号强度可通过感兴趣区域（ROI）内每秒发射的光子数进行测量和量化。由于所获得的图像可清晰显示移植区域的边界，因此也可测量ROI的大小。若每次实验均保持腿部位置一致，则每块肌肉每秒光子总数及ROI大小的变化可反映移植细胞数量及移植区域大小的变化。因此，同一肌肉随时间变化的情况可被定量分析。 在体 荧光成像技术主要被用于追踪肿瘤细胞的生长，而我们的研究表明，它也是一种强大的工具，使我们能够追踪移植干细胞的命运。

我们描述了一种 体内 通过将GFP标记的成肌细胞移植到健康和肌营养不良小鼠的骨骼肌中，利用荧光成像方案监测肌肉再生。该方案可适用于其他类型细胞的移植研究，以及多种其他肌肉状况下的肌肉再生研究。

肌营养不良症是一组以进行性丧失收缩性肌细胞为特征的变性肌肉疾病。目前尚无……

大家好，我是来自波士顿贝格汉姆妇女医院麻醉科的Juwan Ma。今天我们将向您展示一种获取活体荧光图像的技术，用于监测小鼠肌肉再生的进程。在我们的实验室中，利用该方法研究移植肌肉干细胞的植入情况。下面我们开始。用于移植的GFP标记细胞从GFP转基因小鼠中分离并培养。在继续操作前，通过脚趾夹捏确认小鼠已完全麻醉。随后去除后肢肌肉，在无菌条件下将肌肉组织进行机械分散。通过将肌肉碎块与2%胶原酶溶液在37摄氏度下孵育一小时来解离卫星细胞。孵育结束后，加入含有Ham F-10和20%胎牛血清（FBS）的生长培养基以终止酶消化。随后使用移液管反复吹打使肌肉组织进一步解离。随后将细胞通过细胞筛过滤，并接种至未包被的培养皿中。将培养皿置于标准细胞培养孵育箱中孵育1小时。为了分离黏附性较弱的卫星细胞与其他黏附性较强的细胞群体，将上清液倾倒至胶原蛋白包被的培养皿中，再孵育1小时。经过此孵育后，再次移除获得的富含卫星细胞的上清液，并将其接种至新的胶原包被培养板中，继续培养直至观察到成肌细胞克隆。该过程称为预铺板纯化。当细胞达到60%至70%融合度时进行传代。取少量细胞用于免疫细胞化学分析，通过成肌细胞标志物染色以验证培养物中肌细胞的纯度。一旦确认成肌细胞的纯度，便在相同的培养条件下扩增细胞。在细胞移植前，用含0.25%胰蛋白酶和EDTA的溶液消化细胞使其脱离培养皿，随后将细胞洗涤两次，并重悬于HBSS中，细胞浓度为每毫升5×10⁷个细胞。每只胫骨前肌（tibialis anterior，TA）注射10微升细胞悬液。进行活体成像时，首先将表达GFP标记的成肌细胞移植到4至6周龄的雄性小鼠体内。使用氯胺酮和甲苯噻嗪对小鼠进行麻醉，并在确认麻醉状态后开始操作。为降低背景噪声，需将脱毛剂涂抹于双侧后肢，等待30秒后擦除，以去除腿部毛发。对于棉签，需使用浸有蒸馏水的新棉签再次擦拭腿部，以去除残留的鼻腔分泌物和毛发，从而将细胞移植到小鼠体内。首先用 Hamilton 注射器吸取五次、每次 10⁵ 个细胞（溶于 10 µL HBSS 中）。使用 30 号针头，将等量的细胞注射至胫骨前肌（TA 肌）长轴方向上的三个位置，即上部、内侧和下部。每次注射后，需将针头在肌肉内留置两分钟，再将其拔出，以防止液体沿针道渗漏。在等待期间，将相同数量的细胞吸入另一支注射器中，并以相同方式注射对侧胫骨前肌。细胞注射完成后，立即将小鼠俯卧置于一张黑色非荧光纸上，将双足固定于纸面，足底朝下，并将双腿分开呈90度角。随后将小鼠放入Night Owl LB 981荧光成像系统的成像室中。使用配备高灵敏度电荷耦合相机的设备，将一只后肢置于相机视野中心。首先，拍摄腿部的传统灰度照片。开始成像时，选择适用于绿色荧光蛋白的特定波长的合适发射滤光片。先以1,250毫秒的曝光时间拍摄一张图像，随后以500毫秒的曝光时间拍摄另一张图像。我们发现，较长的曝光时间有助于检测微弱信号，而较短的曝光时间则能揭示更多细节。完成一条后肢的成像后，将另一条后肢置于相机视野中心，并以与之前相同的方式对该后肢进行成像。为确保结果具有可比性，标本高度应保持不变。成像完成后，将小鼠放回笼中，并监测其从麻醉状态恢复的情况。进行分析时，需在荧光信号区域绘制感兴趣区域，以测量每秒光子数。我们还通过测量感兴趣区域的像素数量来获取额外的定量数据，以获得纵向数据；可根据需要在不同日期或数周后重复进行成像实验。在实验中，小鼠后肢在注射GFP标记细胞当天拍摄的荧光图像显示出较高的信号强度。随后，信号强度在第二天下降，并在第7天、第14天和第21天逐渐回升至稳定水平。当通过每秒光子数来定量分析荧光信号的变化时，我们观察到注射后一天信号强度显著下降，反映出GFP阳性细胞数量的减少。然而，在第7天、第14天和第21天，信号强度已增加至稳定水平，表明肌肉再生已经发生。我们刚刚向您展示了如何利用活体荧光成像技术来监测注射GFP标记细胞后肌肉再生的进程。通过该方法，我们能够研究注射各种荧光标记细胞后肌肉再生的动态过程。由于可以在指定时间间隔内无创地获取图像，因此能够以更少的动物数量和更轻的工作量收集到更准确的纵向数据。当使用固定的测量参数时，同一只动物在不同时间点获取的图像应具有可定量比较性。保持肌肉表面皮肤的清洁至关重要，必须彻底清除腿部的所有毛发，并用棉签或棉垫彻底擦拭该区域，以降低背景干扰。请记住，每次测量时务必使用相同的参数设置，以确保所有测量结果之间的一致性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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本文介绍了一种对移植于小鼠体内的荧光标记人子宫内膜组织片段进行活体成像的实验方案。该方法可通过实时监测和定量荧光报告分子所发出的荧光信号，研究选定药物对子宫内膜异位病灶大小的影响。...

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