对于斑马鱼精子超低温冷冻保存的一个高通量的方法和施肥

大家好，我是来自加州大学戴维斯分校分子与细胞生物学系的 Bruce Draper，我是来自西雅图 Fred Hutchinson 癌症研究中心基础科学部的 Cecilia Moans。今天，Cecilia 和我将演示斑马鱼精子哭泣保存方案，这是对原始 Brian Harvey 方案的修改。我们将向您展示，以两人一组的方式工作，可以在两个小时内冷冻保存 100 个男性的精子。

虽然解冻后的受孕率范围很广，但平均而言，我们获得了 25% 的受孕率，而这是来自一个已经冷冻保存了七年以上的文库。那么让我们开始吧。在执行此程序之前，首先，制作精子冷冻溶液。

Ginsburg Fish ringer 溶液每三天新鲜制备一次，冷冻培养基每天新鲜制备，含甲醇和不含甲醇。这些溶液的组成可以在本实验步骤随附的在线补充信息中找到。此过程中使用的材料会影响冷冻和解冻的速度，进而影响冷冻精子的生育能力。

因此，还提供了推荐材料清单作为补充在线信息。最好将精子冷冻在细碎的干冰上，而不是干冰颗粒上。粉碎干冰的一种简单方法是用毛巾包起来，然后用锤子将其粉碎。

更有效的方法是使用干冰研磨机（如爪子）和 RE 2 型来冷冻斑马鱼精子。首先，用实验室笔在距底部 3.33 微升或约 16.7 毫米的水平上标记 10 微升毛细管，麻醉雄性，将 2 至 4 只雄性放入装有 trica 稀释和鱼水的烧杯中。食谱可以在斑马鱼书中找到。

麻醉后，用塑料勺将鱼从麻醉剂中取出，然后在纸巾上轻轻吸干。特别注意画出腹侧。水会激活精子，因此在 ika 周围彻底干燥至关重要。

将鱼放在海绵架上的腹侧朝上。如果腹鳍周围的区域仍然潮湿，请用 Kim 湿巾轻轻擦干。将标记的毛细管放入毛细管随附的橡胶口移液器适配器中。

适配器是一根橡胶软管，一端有吹嘴，另一端有毛细管支架。或者，可以将毛细管连接到 50 μL Hamilton 注射器。使用一小段适当直径的 tigon 管，将雄性置于内窥镜下，并通过小心地将腹腔鳍分开来露出泌尿生殖道口。

使用毛细管的末端，通过用光滑的镊子轻轻抚摸鱼的侧面或用食指和拇指轻轻挤压鱼的侧面来挤出精子，将精子收集在毛细管中，然后轻轻抽吸将其排出。避免可能随精子排出的粪便。精子的目标体积为 3.3 微升。

可接受的最小精子量取决于精子的质量。好的精子是白色和不透明的，而毛孔精子看起来是水的。一般来说，可接受的最小精子量是 1 微升优质精子或目标的三分之一，以及 2 微升毛孔精子或目标的三分之二。

如果精子体积未达到 3.3 μL 的目标体积，则必须使用不含甲醇的冷冻培养基将精子体积标准化为笔痕。如果精子量已经达到或超过毛细管上的笔印，则进行下一步。现在将冷冻保护剂添加到精子中。

用甲醇吸取冻存介质至橙色标记。现在大约总体积为 20 微升。将精子和冷冻保护剂混合物排出到手表玻璃的干净区域，上下吹打约四次，轻轻混合，避免引入气泡。

将 10 微升精子冷冻保护剂溶液移液到每个标记的小瓶底部，将精子分装到两个冷冻瓶中。快速移动，盖上样品瓶盖，然后将每个冻存管放入单独的 15 mL Falcon 管中。在室温下，盖上猎鹰管并将它们插入细粉干冰中。

试管应插入足够深，以便仅显示瓶盖以跟踪 falcon 试管。对它们进行编号并记录每根管子进入干冰的时间。让精子在干冰中冻结 20 分钟。

精子冷冻后，将两个冷冻瓶转移到含液氮的 doer 烧瓶中。用于临时存储。将冻存盒放入液氮浴中，以免样品升温。

使用长金属钳从 Doer 烧瓶中回收样品瓶，并戴上冷冻手套处理它们。或者，可以将冻存管直接从干冰转移到冰箱中。如果冷冻箱浸入聚苯乙烯泡沫塑料容器中的液氮中进行长期储存，请将冻存管放入低温液氮冰箱中。

为了保持精子活力，将小瓶浸入液氮小瓶中储存至关重要，因为液氮小瓶以气相储存可能会随着时间的推移而失去活力。速度对于维持精子活力也至关重要。添加冷冻保护剂和将精子瓶放在干冰上的时间不应超过 30 秒体外受精。

使用冷冻保存的精子最适合两个人。一个人从雌性身上挤出卵子，而另一个人解冻精子。将水浴设置为 33 摄氏度。

从液氮冰箱中取出冻存管，将其转移到含 D 的液氮或烧瓶中，直至准备好解冻。将麻醉雌性的卵子挤入 35 毫米的塑料培养皿中。这在题为"通过早期压力使 Gyno Genetic 部署斑马鱼"的 JoVE 协议中进行了详细描述，该协议提供了斑马鱼的详细描述。

在体外受精中，一个好的离合器包含 150 多个均匀且淡黄色的鸡蛋。任何白色碎片都表明存在降解。如果可能的话，尽量获得三窝鸡蛋并合并成一个盘子。

如果在第一个离合器的一分钟内没有获得三个良好的离合器，则继续下一步。精子解冻时，将培养皿盖上。同时，从液氮中取出样品瓶并取下瓶盖。

将样品瓶快速浸入 33 度水浴中 8 到 10 秒。将 70 μL 室温 Hank 缓冲盐溶液快速加入样品瓶中，上下吹打混合，立即加入培养皿中的鸡蛋中，并用移液器吸头轻轻混合。然后立即加入 750 微升鱼水漩涡混合并在室温下孵育 5 分钟，以激活精子和卵子。

五分钟后，在盘子里装满鱼、水，并在 28 摄氏度下孵育。两到三个小时后，计数活胚胎并将其转移到 100 毫米培养皿中，每个培养皿 50 个胚胎。还要依靠受精卵，这样就可以确定精子样本的生育能力。

精子生育能力是活胚胎与用于体外受精的卵子总数的比率。鸡蛋可以在体外受精后 2 到 6 小时内的任何时间进行分类。当不育卵很容易与有活力的胚胎区分开来时，不育卵是清澈且未分裂的。

在立体显微镜上用透射照明观察时，冷冻保存的精子的平均生育能力差异很大。但是，应该有可能获得平均 25% 的生育率，并且能够稳定多年。该图显示了 2001 年至 2003 年间冷冻精子的平均生育率，最近一次被认为是 2008 年。

我们刚刚展示了一种高通量保存零鱼精子的方法。在执行此协议时，重要的是要使用所有推荐的塑料磨损和设备，以及使用粉碎的碎干冰而不是干冰颗粒。使用真正高质量的精子和卵子至关重要，对于卵子，在进行体外受精时，在精子下，重要的是要使用尽可能多的卵子来提高您在另一端获得的受精胚胎的数量，这可能需要三到四个女性， 右？

该协议的另一个关键组成部分是速度。从挤出雄性精子到将其放入干冰中，时间不应超过一分钟。嗯，我想就是这样。

祝你的实验好运。